Transcription de la vidéo
Dans cette vidéo, nous allons discuter du clonage de séquences d’ADN. Tout d’abord, nous allons définir le clonage de l’ADN et l’ADN recombinant, puis nous verrons comment le processus de clonage utilise des plasmides ainsi que des enzymes de restriction et de l’ADN ligase. Nous verrons ensuite comment les cellules bactériennes peuvent être transformées avec de l’ADN recombinant pour fabriquer des clones. Enfin, nous examinerons comment les gènes d’intérêt sont isolés pour le clonage à l’aide de la transcriptase inverse et de la PCR.
Les cellules nucléées de notre corps contiennent de l’ADN qui nous donne les instructions nécessaires à la vie. Ces instructions dans l’ADN sont organisées en gènes qui contrôlent l’expression de plusieurs de nos traits. Ils peuvent contrôler la couleur de nos yeux, notre taille et bien sûr notre santé et déterminer si nous serons atteints ou non d’une maladie. Par exemple, l’insuline, une hormone capable de contrôler la glycémie, est codée et produite par un gène.
L’insuline peut indiquer à la cellule d’absorber du glucose à utiliser comme énergie. Une maladie appelée diabète peut réduire la quantité d’insuline dans le corps. Et si la quantité d’insuline est insuffisante, la cellule n’est pas capable d’absorber le glucose dont elle a besoin pour remplir ses fonctions. Ainsi, les diabétiques doivent s’administrer de l’insuline périodiquement afin de s’assurer que les cellules absorbent le glucose dont elles ont besoin. Mais d’où vient cette insuline?
Croyez-le ou non, nous pouvons l’extraire des animaux, comme les cochons. Et c’était le cas pendant de nombreuses années parce que l’insuline du porc est similaire à l’insuline humaine. Cependant, des réactions allergiques pouvaient néanmoins survenir. L’insuline du porc n’était donc pas idéale. Dans les années 1970, nous avons réussi à remplacer l’insuline du porc en utilisant un organisme qui va probablement vous surprendre: des bactéries. Comment est-ce donc possible? Eh bien, il est possible de prendre notre gène codant pour l’insuline humaine et de l’insérer dans l’ADN bactérien. La bactérie produira ensuite de l’insuline humaine. Elle peut ensuite être extraite, purifiée et utilisée pour traiter le diabète.
Le moment est venu de définir quelques termes clés qui seront utilisés dans cette vidéo. Faisons donc de la place à gauche de l’écran. Ce processus que nous venons de décrire est appelé clonage de l’ADN. Le gène de l’insuline humaine est, ici, inséré dans l’ADN bactérien. Et cela correspond en fait à la création d’une copie génétiquement identique ou un clone du gène de l’insuline. Nous pouvons également le formuler avec un verbe et dire que nous avons, dans cet exemple, cloné le gène de l’insuline.
Notre deuxième définition est l’ADN recombinant. Lors du clonage de l’ADN, l’ADN bactérien est souvent choisi pour porter notre gène d’intérêt, celui de l’insuline dans cet exemple. Nous avons donc de l’ADN provenant de deux sources: un ADN humain, montré ici en vert, et un ADN bactérien, indiqué ici en noir. Ces deux sources d’ADN sont ensuite combinées pour former ce que nous appelons l’ADN recombinant.
Maintenant que nous avons vu les grandes lignes du clonage d’ADN, détaillons un peu plus ce processus. Nous allons commencer par discuter de la fabrication de l’ADN recombinant. Voici donc notre ADN recombinant combiné à partir de deux sources. Nous pouvons voir notre gène d’intérêt en vert et l’ADN bactérien en noir. Cet ADN bactérien provient d’un type spécial d’ADN appelé plasmide. Si nous regardions à l’intérieur d’une cellule bactérienne, nous remarquerions qu’il y a deux types d’ADN. Il y a le chromosome bactérien, qui est souvent un grand morceau d’ADN circulaire contenant les informations nécessaires au cycle de vie de la bactérie. Et il y a le plasmide, une autre molécule d’ADN circulaire qui peut se partager entre bactéries.
Les plasmides peuvent contenir certains gènes, tels que les gènes d’antibiorésistance, qui peuvent être bénéfiques à la croissance des bactéries dans certaines conditions et qui peuvent également permettre aux scientifiques de sélectionner les bactéries ayant absorbé le plasmide. Ces plasmides sont capables de se répliquer indépendamment de l’ADN chromosomique. Et une bactérie peut avoir à elle seule des centaines de copies d’un plasmide particulier.
Le plasmide peut également être appelé vecteur, car il peut contenir notre gène d’intérêt et être intégré dans notre bactérie, où il est traité comme un plasmide ordinaire. Cela signifie qu’elle peut non seulement exprimer notre gène d’intérêt, mais également faire plusieurs copies ou clones de ce gène lorsque le plasmide se réplique. D’autre part, ces plasmides sont transmis d’une bactérie à l’autre lorsqu’elles se divisent, ce qui génère encore plus de copies.
Parlons maintenant de la façon dont le plasmide et notre gène d’intérêt peuvent être assemblés pour former l’ADN recombinant. Nous allons donc commencer avec notre plasmide Mais rappelez-vous, l’ADN est double brin. Alors rajoutons le pour être un peu plus précis. C’est déjà mieux. Et nous avons, ici, notre deuxième source d’ADN contenant notre gène d’intérêt. Afin d’incorporer notre gène d’intérêt dans le plasmide bactérien, nous avons besoin de quelque chose pour exciser l’ADN et insérer ce gène. Qu’est-ce qui coupe encore mieux qu’une paire de ciseaux? Et oui, des ciseaux moléculaires. Vous vous souviendrez que les enzymes de restriction ou les endonucléases de restriction sont des enzymes spéciales qui agissent comme des ciseaux moléculaires pour couper l’ADN. Ainsi, notre plasmide peut être coupé ici, et notre gène d’intérêt peut se couper des deux côtés.
Voyons à quoi cela ressemble dans la séquence d’ADN en question. Nous allons commencer par le plasmide. Les enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau de leur site de restriction. La séquence GGATCC est le site de reconnaissance de l’enzyme de restriction BamHI. BamHI coupe l’ADN comme indiqué et produit ces deux extrémités. Celles-ci sont appelées des extrémités cohésives parce qu’elles ont des nucléotides non appariés qui peuvent se coupler avec des nucléotides complémentaires sur un brin d’ADN opposé. La séquence GATC est donc complémentaire à la séquence CTAG. Ces deux extrémités peuvent alors former des liaisons hydrogène entre elles, c’est pourquoi elles sont dites cohésives.
Maintenant que nous avons coupé notre ADN à droite, voyons comment procéder sur la figure du plasmide à gauche. Vous remarquerez que ce schéma, ici, présente encore une fois les deux bouts collants. Ainsi, cette section, ici, correspond à cette extrémité cohésive, et cette section, ici, correspond à cette extrémité cohésive.
Alors, maintenant que nous avons ouvert notre plasmide en utilisant l’enzyme de restriction BamHI, faisons de même pour notre gène d’intérêt en bas. Nous pouvons donc maintenant voir à droite que notre séquence contenant notre gêne d’intérêt est entourée par deux sites de restriction BamHI. Et nous pouvons maintenant couper ces séquences avec notre enzyme de restriction BamHI pour obtenir les motifs de coupe indiqués. Notre gène d’intérêt est ainsi libéré, et possède maintenant deux extrémités cohésives. Ces extrémités cohésives sont compatibles avec les deux extrémités cohésives du plasmide coupé. Nous pouvons donc maintenant les combiner. C’est bien mieux comme çà.
Faisons maintenant la même chose sur les figures à gauche pour voir ce que çà donne. Ainsi, les excisions générées par l’enzyme de restriction, indiquées ici, peuvent se fixer dans notre plasmide coupé, comme vous pouvez le voir ici. Vous avez donc peut-être remarqué qu’il y a des lacunes dans la figure de gauche, dont l’une est indiquée par ce carré rose. Nous pouvons également le voir dans la séquence à droite. Ces lacunes représentent des liaisons phosphodiester manquantes dans le squelette sucre-phosphate de l’ADN.
Zoomons et voyons à quoi elles correspondent. Nous pouvons voir, ici, la structure chimique des deux brins d’ADN. Le brin à gauche est le brin cinq prime -trois prime. Et sur la figure supérieure, il correspond à la séquence du haut, alors que la séquence du bas est le brin trois prime - cinq prime, qui correspond à la structure de droite sur la figure du bas.
Les nucléotides sont liés entre eux par des liaisons phosphodiester comme indiqué ici. Les enzymes de restriction excisent cette liaison phosphodiester, et c’est comme çà que la lacune apparait. Ainsi, à ce stade, la seule chose qui retient notre gène d’intérêt dans le plasmide est la liaison hydrogène entre les extrémités cohésives. Pour combiner ces deux molécules d’ADN de manière permanente, nous devons réparer l’abscence de cette liaison phosphodiester. Pour ce faire, nous pouvons utiliser une enzyme appelée ADN ligase, capable de catalyser la formation d’une liaison phosphodiester. L’ADN ligase peut donc combler tous les trous du squelette sucre-phosphate introduits par l’enzyme de restriction. Vous pouvez le voir ici en haut et ici à gauche également.
Notre ADN recombinant est enfin complètement assemblé et prêt pour la prochaine étape, son transfert dans des bactéries. Cette étape est appelée la transformation. Au cours de la transformation, les bactéries sont exposées à un certain composé chimique et à une température qui les rendent plus perméables à l’ADN. De cette façon, l’ADN recombinant mélangé avec la bactérie est facilement absorbé dans son cytoplasme.
L’ADN recombinant peut maintenant être exprimé en utilisant les composants bactériens pour former la protéine correspondant à notre gène d’intérêt. Si le gène codait, par exemple, pour l’insuline, nous pourrions alors collecter la protéine de l’insuline. Une seule molécule d’ADN recombinant est présentée ici par souci de simplicité. Mais plusieurs copies seront en réalité produites puisqu’elle se répliquera exactement comme le fait un plasmide. De plus, les bactéries se diviseront et ferons encore plus de copies. En fin de compte, notre protéine sera produite en grande quantité.
Maintenant que nous avons vu comment le clonage de l’ADN se déroule, le prochain sujet concerne la façon dont notre gène d’intérêt est isolé pour le clonage. Normalement, les informations génétiques vont de l’ADN à l’ARNm et enfin à la protéine. Un gène dans l’ADN peut être converti en ARNm par transcription. Il est également possible de réaliser le processus inverse, qui consiste à reconvertir l’ARNm en ADN. Ce processus s’appelle la transcription inverse. Si nous voulons cloner un gène particulier, nous pouvons donc isoler l’ARNm et le rétrotranscrire en ADN.
Il est important de travailler avec la forme ADN car les enzymes de restriction et les plasmides, dont nous avons besoin pour le clonage, n’agissent généralement que sur l’ADN. Alors, comment pouvons-nous isoler cet ARNm afin de fabriquer l’ADN de notre gène d’intérêt?
Supposons que notre gène d’intérêt code pour l’insuline. Nous savons que le pancréas contient des cellules qui produisent beaucoup d’ARNm d’insuline. C’est donc un bon point de départ. Dans un laboratoire, nous pouvons collecter ces cellules et extraire cet ARNm. Nous pouvons ensuite effectuer une transcription inverse sur l’ARNm pour fabriquer de l’ADN d’insuline que nous pouvons ensuite cloner en l’insérant dans un plasmide.
Écrivons maintenant la séquence d’ARNm afin de comprendre comment la transcription inverse se déroule réellement. Voici donc notre ARNm et l’enzyme responsable de la transcription inverse que nous appelons la transcriptase inverse ou rétrotranscriptase. Puisqu’elle ajoute des nucléotides d’ADN complémentaires à l’ARNm, son produit correspond à de l’ADNc ou ADN complémentaire. Lorsque la transcriptase inverse se déplace le long de l’ARNm dans la direction cinq prime - trois prime, elle ajoute ces nucléotides complémentaires à la molécule d’ADNc en cours.
Maintenant que la molécule d’ADNc est terminée, revoyons rapidement quelques éléments. Souvenez-vous que la thymine dans l’ADN est remplacée par de l’uracile dans l’ARNm. Et l’uracile forme une paire de base avec l’adénine comme indiqué ici. Dans l’ADN, nous avons la thymine qui peut s’associer à l’adénine de l’ARNm. Associer l’adénine à l’uracile est une erreur courante, mais la transcription inverse produit de l’ADNc et non de l’ARNm. Il faut donc s’assurer que ce sont les bons nucléotides qui sont utilisés.
Nous voulons maintenant nous débarrasser de l’ARNm du complexe d’ARNm et d’ADNc et le remplacer par un autre brin d’ADN pour former une molécule d’ADN double brin. De cette façon, nous pouvons l’utiliser pour le clonage ADN. Au laboratoire, nous pouvons donc utiliser une enzyme spéciale qui dégrade et élimine spécifiquement cette molécule d’ARN.
Maintenant que l’ARNm est enlevé, il ne nous reste plus que l’ADNc simple brin. La prochaine étape consiste à rendre cet ADN double brin. Et pour cela, nous pouvons utiliser notre vieil ami l’ADN polymérase qui, comme vous vous souvenez peut-être, joue un rôle important dans la réplication de l’ADN avant la division cellulaire. L’ADN polymérase peut ainsi se lier à la molécule d’ADNc simple brin et ajouter les nucléotides complémentaires pour former le deuxième brin d’ADN. Notre molécule d’ADN double brin est maintenant prête pour le clonage de l’ADN.
Nous pouvons également faire plusieurs copies d’une molécule d’ADN en utilisant une autre technique appelée réaction en chaîne par polymérase, ou PCR. C’est une technique de laboratoire qui nous permet de cibler des régions spécifiques de l’ADN d’un organisme pour en faire plusieurs copies. Les clones de notre gène d’intérêt sont créés sans même utiliser de bactéries. Cependant, dans certaines situations, nous pouvons utiliser ces copies pour former un ADN recombinant qui peut ensuite être utilisé dans la transformation bactérienne. La protéine peut ainsi être fabriquée. La PCR représente donc un autre moyen d’isoler notre gène d’intérêt.
Maintenant que nous avons vu comment fonctionne le clonage et comment isoler les gènes à utiliser dans le clonage, il est temps de se pencher sur une question pratique.
L’utilisation de plasmides pour former un ADN recombinant est crucial dans le clonage d’ADN. Quels sont micro-organismes à l’origine des plasmides?
Afin de répondre à cette question, prenons un exemple de clonage du gène interféron. Les interférons sont des protéines qui peuvent interférer avec la réplication virale. Ils sont de ce fait efficaces comme médicaments antiviraux. Ils peuvent également être utilisés pour traiter certaines maladies, telles que le cancer et la sclérose en plaques. L’interféron était autrefois extrait de cellules, ce qui le rendait très cher. Aujourd’hui, on peut utiliser un processus appelé clonage d’ADN. Celui-ci consiste à faire une copie ou un clone du gène codant pour l’interféron. Ce processus commence avec l’isolation du gène codant pour l’interféron et son insertion dans un morceau circulaire d’ADN bactérien appelé plasmide.
Les plasmides ont été initialement découverts dans les bactéries et désignent des morceaux d’ADN non chromosomique qui se répliquent de manière indépendante. Une cellule unique peut avoir des centaines de copies d’un seul type de plasmide. Dans le clonage, ils servent à porter des gènes dont nous voulons faire des copies. Dans ce cas, ils sont alors parfois appelés vecteurs. À gauche, vous remarquerez que l’assemblage que nous avons fait contient de l’ADN provenant de deux sources. L’une des sources est l’ADN du gène interféron humain, et l’autre vient de l’ADN du plasmide de la bactérie. Lorsque deux sources d’ADN sont ainsi combinées, on parle d’ADN recombinant.
Dans la dernière étape du processus de clonage, cet ADN recombinant peut ensuite être transféré dans des cellules bactériennes. La cellule bactérienne peut alors exprimer ce gène pour produire la protéine interféron. Seule une copie de l’ADN recombinant est illustrée ici. Mais elle se répliquera dans la cellule et fera de nombreuses copies. Et il y aura davantage de copies à mesure que les bactéries se divisent. La production d’interféron sera alors conséquente et pourra ensuite être extraite et utilisée à des fins médicales. Les plasmides sont indispensables au clonage de l’ADN car ils sont utilisés pour porter le gène que nous voulons cloner. Les plasmides ont été initialement découverts dans les bactéries.
Passons maintenant en revue certains des points clés que nous avons couverts dans cette vidéo. Le clonage d’ADN est un processus qui fabrique des copies ou des clones d’un ADN spécifique qui nous intéresse. Cet ADN peut être cloné dans un plasmide. Ces deux sources ADN, l’ADN spécifique qui nous intéresse et le plasmide, peuvent être combinées pour former un ADN recombinant. L’ADN recombinant peut être conçu en coupant l’ADN à l’aide d’enzymes de restriction, puis en l’insérant dans le plasmide. L’ADN ligase peut ensuite former de nouvelles liaisons phosphodiester au niveau des extrémités excisées par l’enzyme de restriction. Puis l’ADN recombinant est utilisé dans la transformation bactérienne, au cours de laquelle plusieurs copies sont produites et exprimées à l’aide de composants bactériens. Enfin, l’ADN spécifique que nous voulons cloner peut être isolé par le biais de la transcription inverse ou de la PCR.