Vidéo de la leçon: Utilisation des enzymes de restriction Biologie

Transcription de la vidéo

Dans cette vidéo, nous allons découvrir les enzymes de restriction, un groupe d’enzymes spécialisées dans la coupure de l’ADN. Nous allons également apprendre comment ils ciblent l’ADN, les séquences spécifiques qu’ils reconnaissent et ce qu’est un palindrome exactement. Après avoir coupé l’ADN, les enzymes de restriction peuvent laisser des extrémités dites cohésives, et nous verrons en quoi elles sont si importantes. Donc, ne perdons plus de temps et commençons cette leçon.

Les enzymes de restriction, également appelées endonucléases de restriction, font partie d’un groupe spécial de protéines, les enzymes. Une enzyme est une protéine qui agit comme un catalyseur biologique, ce qui signifie qu’elle peut accélérer une réaction chimique. Chaque enzyme a un substrat spécifique avec lequel elle interagit. Le substrat est capable de se lier très spécifiquement à l’enzyme. À ce moment là, l'enzyme est capable d'agir sur le substrat pour accélérer une réaction chimique, telle que le clivage du substrat, représenté dans l'exemple suivant. Ces produits peuvent alors quitter l'enzyme, qui est à nouveau libre d'accepter un autre substrat.

Une enzyme de restriction est un type particulier d'enzyme qui catalyse le clivage de l'ADN, son substrat, au niveau de séquences de reconnaissance spécifiques dans l'ADN. D’une certaine manière, elles sont un peu comme des ciseaux moléculaires qui peuvent couper l’ADN à des séquences spécifiques. Cela produit des fragments de différentes longueurs, comme indiqué ici. Alors, comment une enzyme de restriction coupe-t-elle l’ADN? Examinons de plus près ce segment et récapitulons la structure de l'ADN.

L’ADN est double brin. Mais par souci de simplicité, nous allons nous contenter de ce simple brin. L’ADN est composé de sous-unités répétitives appelées nucléotides. Il comprend un groupe phosphate, un sucre désoxyribose et une base azotée. Il existe quatre bases dans l’ADN: l’adénine, la guanine, la cytosine et la thymine. On peut voir ici en noir ce que l’on appelle le squelette sucre-phosphate. C’est là que les nucléotides sont reliés par des liaisons phosphodiester. Les enzymes de restriction peuvent couper cette liaison phosphodiester. Cela crée une rupture dans le squelette sucre-phosphate, que nous pouvons voir ici. L’enzyme de restriction peut également cliver la liaison phosphodiester sur l’autre brin, comme indiqué ici, et c’est ainsi qu’une enzyme de restriction peut couper l’ADN.

Vous vous demandez peut-être quel est le rôle des enzymes de restriction? À quoi servent-elles au juste? Dans les années 1950, des recherches ont conduit à leur découverte chez des bactéries, qui étaient plus résistantes à l’infection virale que d’autres. Un bactériophage est un type de virus qui infecte les bactéries. Il contient à l’intérieur de sa tête de l’ADN viral. Ce bactériophage peut se fixer à la surface d’une bactérie et injecter son ADN dans son cytoplasme. Une fois l’ADN viral injecté, il peut utiliser les ressources bactériennes pour construire de nouveaux composants viraux. Ceux-ci peuvent ensuite être assemblés pour construire de nouveaux bactériophages.

Ce processus se répète, et la bactérie se remplit de virus jusqu'à ce que la cellule finisse par éclater et libérer tous les virus pour infecter d'autres cellules. Ces bactéries sont vulnérables aux infections virales. Cependant, certaines bactéries se sont avérées résistantes à l’infection causée par un bactériophage. Ces bactéries possèdent des enzymes de restriction, qui coupe l’ADN viral en fragments. Ces fragments ne peuvent plus être utilisés pour construire de nouveaux composants viraux, de sorte que le virus n’a plus la capacité d'infecter la cellule.

Ainsi, les enzymes de restriction sont en fait un mécanisme développé par les bactéries pour se défendre contre les infections virales. Notez que les bactéries peuvent protéger leur propre ADN contre les coupures en ajoutant des groupes méthyles spéciaux à leur ADN. Ces séquences ne sont alors plus reconnues par les enzymes de restriction. Voyons maintenant comment les enzymes de restriction s’associent à leur site de reconnaissance.

Un site de reconnaissance est une séquence d'ADN à laquelle une enzyme de restriction se lie pour la cliver. Il s’appelle aussi le site de restriction. Voici quelques exemples d’enzymes de restriction ainsi que leur site de reconnaissance. Chaque enzyme de restriction reconnaît une séquence spécifique et coupe la séquence entre des bases spécifiques. Par exemple, Eco RI reconnaît la séquence G/AATTC, qu’elle coupe entre la guanine et l’adénine, comme indiqué ici. Ces sites de reconnaissance ont une particularité dont nous parlerons plus tard. Mais d'abord, passons en revue la directionnalité de l'ADN.

Voici un segment d’une molécule d’ADN. Vous remarquerez qu’il a deux brins. L'un de ces brins va dans cette direction, tandis que le brin opposé va dans cette direction. Zoomons sur ce segment de la molécule pour le voir plus en détail. Le brin à gauche descend alors que le brin à droite monte. Cette direction est due à la façon dont les nucléotides sont ajoutés pendant la synthèse de l'ADN.

Les nucléotides ne sont ajoutés que dans la direction cinq prime à trois prime, ce qui fait référence aux numéros des carbones dans le nucléotide. Ces numéros sont indiqués ici. Notez que le cinq prime est au-dessus du trois prime. Donc, ce brin est parfois nommé le brin cinq prime à trois prime. Vous pouvez le voir ici. Alors que cinq prime vers trois prime sur l’autre brin va dans la direction opposée, ce que vous pouvez voir ici.

Examinons maintenant la séquence de reconnaissance d’Eco RI sur les deux brins. Voici la séquence de reconnaissance GAATTC, qui par convention s’écrit dans le sens cinq prime vers trois prime. Et voici la séquence sur le brin opposé trois prime à cinq prime. Avez-vous remarqué quelque chose de similaire à propos de ces séquences? Si vous lisez la séquence sur le brin supérieur, GAATTC, il s’agit de la même séquence que sur le brin inférieur lorsqu’elle est lue en sens inverse, GAATTC. C’est en fait un exemple de palindrome, un mot ou une phrase qui se lit de la même façon que ce soit à l'endroit ou à l'envers. Par exemple le mot kayak se lit toujours kayak que vous le lisiez dans un sens ou dans l’autre. De nombreux sites de reconnaissance ont comme caractéristique une séquence palindromique.

Regardons un autre exemple avec l’enzyme de restriction Bam HI. Sur le brin supérieur de Bam HI, on lit GGATCC, qui correspond à la même séquence que le brin inférieur lorsqu'il est lu en sens inverse, GGATCC. Donc, cette séquence est aussi un palindrome. Examinons maintenant les différents modèles de clivage que peuvent réaliser les enzymes de restriction.

Les premiers que nous allons voir sont les extrémités dites cohésives. La séquence de reconnaissance et le site de clivage pour Eco RI sont affichés ici. Indiquons-les pour les deux brins afin de voir comment ils se coupent. La plupart des enzymes de restriction effectuent deux coupures, une sur chaque brin, ce qui peut être représenté comme suit. Cela générera deux fragments. L’un est illustré ici, et l’autre est illustré là. Vous remarquerez que ces deux fragments ont des extrémités saillantes de bases non appariées. Il s’agit des extrémités cohésives, ou collantes, car ces bases sont complémentaires et ont une affinité les unes pour les autres.

Le deuxième type de motif de clivage généré par des enzymes de restriction est appelé extrémité franche ou émoussée. SmaI est un exemple d’enzyme de restriction qui produit une extrémité franche. Un clivage avec SmaI donne un fragment qui ressemble à ceci et un autre fragment qui ressemble à cela. C’est ce que l’on appelle des extrémités franches, et puisqu’elles ne comportent pas de bases non appariées, elles ne sont pas cohésives. Maintenant, concentrons-nous sur les extrémités cohésives et expliquons leur importance.

La création d’extrémités cohésives a une utilité très intéressante. Supposons que nous ayons deux morceaux d’ADN que nous souhaitons coller ensemble. Alors prenons un exemple amusant. Imaginons que nous ayons un poisson de compagnie et que nous voulions le faire briller dans le noir. Eh bien, nous connaissons une certaine méduse qui brille dans le noir. Cette particularité est due à la protéine appelée GFP, la protéine fluorescente verte. Alors, est-il possible d’isoler le gène GFP de l’ADN de la méduse et de l’insérer dans l’ADN du poisson? Bien sûr, grâce aux extrémités cohésives!

Heureusement pour nous, le gène GFP dans l'ADN de la méduse est bordé par deux séquences de reconnaissance Eco RI. Et il y a aussi un site de reconnaissance Eco RI dans l’ADN du poisson. Donc, il nous suffit de couper le gène GFP avec Eco RI et de l’insérer dans le site Eco RI de l’ADN du poisson. Voyons de plus près comment cela fonctionne. Voici le gène GFP avec les deux séquences de reconnaissance Eco RI aux deux extrémités. Et voici un aperçu de l’ADN du poisson avec son unique site Eco RI.

Alors maintenant, nous ajoutons Eco RI à l’ADN de méduse, qu’il coupe comme ceci pour produire ce fragment qui contient le gène GFP. Et nous coupons également l’ADN du poisson avec Eco RI, comme ceci. Maintenant, nous ajoutons notre ADN GFP découpé à l’ADN du poisson coupé. Et puisque ces deux extrémités sont complémentaires, nous pouvons insérer le gène GFP dans l’ADN du poisson. Ce nouveau gène GFP donne à notre ami poisson un tout nouveau look.

Maintenant, appliquons ce que nous avons appris avec une question pratique.

Des échantillons d’ADN sont prélevés à partir de deux organismes et chacun mélangé avec l’enzyme de restriction Bam HI. L’enzyme de restriction coupe l’ADN de l’organisme A en trois segments, mais coupe l’ADN de l’organisme B en seulement deux parties. Qu’est-ce que cela suggère à propos de l’ADN des organismes? L’organisme A possède moins de sites de reconnaissance Bam HI dans son ADN que l’organisme B. L’organisme A possède plus de sites de reconnaissance Bam HI dans son ADN que l’organisme B. L’ADN de l’organisme B est plus long que celui de l’organisme A. Ou l’échantillon prélevé sur l’organisme B n’a pas été mélangé avec suffisamment d’enzymes de restriction.

Cette question nous interroge sur les enzymes de restriction et comment elles peuvent couper l’ADN différemment d’un organisme à l’autre. Cette question a quelques mots clés que nous devons définir. Alors, effaçons les choix de réponse pour avoir la place de travailler. Une enzyme de restriction est un type spécial d’enzyme. Rappelez-vous qu’une enzyme est une protéine qui agit comme un catalyseur biologique. Cela signifie qu’elle peut accélérer une réaction chimique pour qu’elle soit beaucoup plus rapide. Pour ce faire, elle se lie à son substrat spécifique, et crée les conditions permettant à une réaction chimique de se produire beaucoup plus rapidement, comme le clivage du substrat en deux fragments, indiqué ici.

Les enzymes de restriction sont des enzymes qui catalysent le clivage de l’ADN. Les enzymes de restriction sont un peu comme des ciseaux moléculaires qui peuvent couper l’ADN, leur substrat, au niveau de séquences ADN spécifiques qu’elles reconnaissent. Ces séquences d’ADN spécifiques sont appelées des sites de reconnaissance, et chaque enzyme de restriction a une séquence de reconnaissance unique à laquelle elle se lie pour la cliver.

L’enzyme de restriction Bam HI dans cette question a la séquence de reconnaissance GGATCC. Donc, si l’enzyme de restriction qui coupe cet ADN était Bam HI, alors ces deux coupures se feraient au niveau de cette séquence. En d’autres termes, cet ADN possède deux sites de reconnaissance Bam HI. Une fois l’ADN découpé, il y aura des fragments ou des segments d’ADN. Donc, dans l’exemple de ce substrat d’ADN linéaire où il y a deux séquences de reconnaissance Bam HI, il se formera trois parties.

Maintenant, regardons à nouveau la question. La question indique que Bam HI coupe l’ADN de l’organisme A en trois parties, mais coupe l’ADN de l’organisme B en seulement deux parties. Maintenant, résolvons cela en supposant que l’ADN soit linéaire. L’organisme A est coupé avec Bam HI et produit trois fragments. Il doit donc y avoir deux sites de reconnaissance pour Bam HI, alors que dans l’organisme B, il n’y a que deux fragments produits. Cela signifie qu’il n’a qu’une seule séquence de reconnaissance Bam HI. Ainsi, si l’ADN est linéaire, on peut en déduire que l’organisme A possède plus de séquences de reconnaissance que l’organisme B.

Mais qu’en est-il de l’ADN circulaire? L’ADN des bactéries est généralement circulaire. Alors, examinons cette situation avant de choisir une réponse. Voici l’organisme A découpé en trois fragments. Pour produire ce fragment, l’ADN circulaire devrait être coupé ici et là. Et pour produire les deux fragments restants, nous aurions besoin d’une coupure supplémentaire ici. Donc, l’organisme A a un total de trois sites de reconnaissance de Bam HI. Voici les deux fragments produits dans l’organisme B. Et pour produire ces fragments, nous aurions besoin de deux coupures, une ici et une ici. Ainsi, l’organisme B ne possède que deux sites de reconnaissance Bam HI.

Donc, si l’ADN est circulaire, l’organisme A a plus de sites de reconnaissance que l’organisme B. On retombe sur le même résultat que nous avons trouvé avec l’ADN linéaire. Par conséquent, la bonne réponse est que l’ADN de l’organisme A possède plus de sites de reconnaissance Bam HI que celui de l’organisme B.

Maintenant, revoyons quelques-uns des points clés que nous avons couverts dans cette vidéo. Les enzymes de restriction sont des enzymes qui catalysent le clivage de l’ADN. Elles le font en se liant à deux séquences ADN spécifiques appelées sites de reconnaissance, ce qui signifie que la séquence lue sur un brin est la même que lorsqu’elle est lue sur le brin opposé dans le sens inverse. Les enzymes de restriction peuvent couper l’ADN pour produire deux types d’extrémités, les extrémités franches ou les extrémités cohésives. Les extrémités cohésives peuvent être utilisées pour joindre l’ADN à partir de deux sources et ont de nombreuses applications en biotechnologie.