Fiche explicative de la leçon : Utilisation des enzymes de restriction Biologie

Dans cette fiche explicative, nous allons apprendre à expliquer la fonction des enzymes de restriction et à décrire la finalité des extrémités cohésives.

L’ADN est une grosse molécule, et chez l’Homme, il est composé de milliards de paires de bases avec des dizaines de milliers de gènes différents. Pour étudier de manière efficace notre génome, il est plus judicieux de le diviser en tronçons plus petits et plus faciles à manipuler.

Les enzymes de restriction (également appelées endonucléases de restriction) sont comme des ciseaux moléculaires qui peuvent couper des séquences spécifiques d’ADN. Les enzymes de restriction peuvent être utilisées pour découper des gènes d’intérêt afin de les étudier individuellement. Ce mécanisme a conduit à la caractérisation d’un grand nombre de gènes et au développement d’une nouvelle technologie passionnante basée sur l’ADN. La technologie de l’ADN recombinant désigne la combinaison d’ADN provenant de deux sources différentes pour créer de nouvelles informations génétiques. Elle dépend essentiellement des enzymes de restriction, car sans elles, nous n’aurions pas de vaccins, d’insuline ou de nombreux aliments que nous mangeons ! 

Les enzymes de restriction sont présentes naturellement chez les bactéries dans lesquelles elles sont utilisées comme moyen de défense contre les infections virales. Lorsqu’un virus infecte une bactérie, il insère son ADN dans la cellule afin de produire plus de copies de lui-même. La bactérie réagit en produisant des enzymes de restriction qui reconnaissent cet ADN viral et le coupent en morceaux ou en fragments plus petits, ce qui perturbe l’information génétique contenue dans l’ADN viral. Cela empêche le virus de poursuivre son cycle de vie ou le « restreint » d’infecter davantage de cellules bactériennes. Les enzymes de restriction sauvent littéralement la vie des bactéries ! 

Vous vous souviendrez peut-être que les enzymes sont des protéines qui agissent comme des catalyseurs biologiques pour accélérer les réactions chimiques. Les enzymes ont toujours un substrat avec lequel elles interagissent spécifiquement pour générer un produit. Dans le cas des enzymes de restriction, le substrat est un ADN double brin et le produit est un ADN coupé. Les enzymes de restriction peuvent catalyser l’hydrolyse de la liaison phosphodiester qui constitue le squelette de la molécule ADN, pour « couper » l’ADN et former des fragments. Vous pouvez le voir sur la figure 1.

Il existe de nombreux types d’enzymes de restriction, et chacune possède sa propre séquence ADN cible, appelée site de restriction ou site de reconnaissance, que l’enzyme de restriction reconnaît spécifiquement. Sur la figure 2, nous allons examiner l’enzyme de restriction EcoRI (prononcée Eco-R-1), qui reconnaît la séquence d’ADN GAATTC.

EcoRI reconnaît la séquence GAATTC sur le brin supérieur ainsi que la séquence complémentaire correspondante CTTAAG sur le brin inférieur. Voici une observation intéressante : au lieu de lire la suite inférieure de la figure 2 de gauche à droite, essayez de la lire de droite à gauche. Donc, nous lisons « GAATTC » au lieu de « CTTAAG », qui est en fait la même séquence que le brin supérieur ! 

Cette propriété, où la séquence se lit de manière identique de gauche à droite sur un brin et de droite à gauche sur le brin complémentaire, est appelée palindrome. Un exemple courant de palindrome est le mot « radar » ; il se lit la même manière qu’il soit dans un sens ou dans l’autre ! Une séquence palindromique est utilisée par de nombreuses enzymes de restriction pour reconnaitre leur séquence cible.

Lorsqu’il s’agit d’un mot comme « radar », il est logique de décrire la lecture du mot à partir de la gauche ou de la droite. Mais avec l’ADN, il n’y a pas de « gauche » ni de « droite ». Les deux brins d’ADN sont orientés en directions opposées l’une de l’autre, de sorte qu’un brin va dans une direction, tandis que l’autre brin va dans la direction opposée. Mais comment est défini ce sens ? 

Par convention, l’ADN est décrit dans le même sens que celui dans lequel un brin simple d’ADN est synthétisé. L’ADN est toujours synthétisé dans le sens vers , qui font référence aux atomes de carbone où de nouveaux désoxyribonucléotides sont ajoutés dans un brin croissant d’ADN. Les atomes de carbone d’un désoxyribonucléotide sont numérotés de à , comme illustré à la figure 3. Lorsque l’ADN est synthétisé, le groupe phosphate (attaché au carbone ) d’un nouveau désoxyribonucléotide est ajouté au carbone du brin d’ADN croissant.

Maintenant que nous comprenons comment fonctionne l’orientation dans l’ADN, revenons à la séquence palindromique de EcoRI : 

En lisant le brin de vers , nous pouvons voir la séquence GAATTC, et si nous lisons le brin opposé - en sens inverse (de sorte qu’il se dirige de vers ), nous voyons également GAATTC. Comme indiqué précédemment, il s’agit d’un palindrome, et c’est ainsi que les enzymes de restriction peuvent reconnaître leur séquence cible. Tout comme le mot palindromique « radar » se lit de la même façon qu’il commence par la gauche ou par la droite, une séquence palindromique d’ADN se lit pareillement sur les deux brins dans le sens vers .

Exemple 2: Reconnaître les séquences palindromiques

Certaines enzymes de restriction reconnaissent une section d’ADN qui a la même séquence qu’elle soit lue dans le sens - sur un brin que dans le sens - sur le brin complémentaire. Un exemple est illustré sur le schéma.

Quel terme est donné à ce motif ? 

1. palindromique
2. aligné
3. complémentaire
4. superenroulé
5. canonique

Réponse

Les enzymes de restriction sont comme des ciseaux moléculaires qui coupent l’ADN en fragments. Elles sont capables de reconnaître des séquences spécifiques d’ADN appelées sites de reconnaissance. Chaque enzyme de restriction a son propre site de reconnaissance. De nombreuses séquences de reconnaissance sont palindromiques. Cela signifie que la séquence est la même sur les deux brins lorsqu’elle est lue dans le sens vers .

et se réfèrent à l’orientation des atomes de carbone du désoxyribonucléotide. Lorsque l’ADN est synthétisé, le groupe phosphate (attaché au carbone ) d’un nouveau désoxyribonucléotide est ajouté au carbone du brin d’ADN croissant. Cela signifie que chaque brin d’ADN est synthétisé en sens opposés. Par convention, et comme illustré ci-dessous à droite, l’ADN s’écrit dans le sens vers au dessus, avec le brin opposé dans le sens vers en dessous.

Si vous revenez maintenant à la question, vous pouvez voir que la séquence correspond à GAATTC sur les deux brins lorsqu’elle est lue dans le sens vers .

Par conséquent, la bonne réponse est l’option A, palindromique.

GAATTC est le site de reconnaissance de l’enzyme de restriction EcoRI. C’est une séquence palindromique qui a une forme très spécifique reconnue par EcoRI. Ainsi, dans une bactérie qui a été infectée par de l’ADN viral, de nombreuses enzymes de restriction EcoRI s’attacheront à l’ADN viral et le scanneront jusqu’à ce qu’elles trouvent cette séquence. Une fois trouvée, l’enzyme se liera strictement à sa séquence de reconnaissance, et coupera les brins d’ADN en plus petits fragments comme le montre la figure 4.

Étant donné que les instructions génétiques du virus sont contenues dans son ADN, elles sont perdues lorsque l’ADN est coupé par une enzyme de restriction, donc le virus ne peut plus continuer son cycle de vie. Les enzymes de restriction peuvent donc protéger la bactérie, et depuis 2014, plus de 4 000 enzymes de restriction ont été découvertes ! 

Lorsque les enzymes de restriction coupent l’ADN au niveau de leur site de reconnaissance, elles produisent des fragments d’une taille spécifique. Par exemple, si un morceau d’ADN de 1 000 paires de bases contient un site de reconnaissance EcoRI à la 250ème paires de bases, alors l’action de EcoRI produira 2 fragments : un de 750 paires de bases et un autre de 250 paires de bases. Ces séquences de reconnaissance sont aléatoires dans l’ADN. Ainsi, plus les morceaux d’ADN sont longs, plus ils seront susceptibles de contenir davantage de séquences de reconnaissance par rapport à des morceaux d’ADN plus courts.

Étant donné que des enzymes de restriction coupe l’ADN, vous vous demandez peut-être comment l’ADN de l’hôte est préservé. L’ADN peut être modifié par méthylation, où des groupes méthyle sont ajoutés à certaines séquences de nucléotides. Ceci peut changer la forme du site de reconnaissance, avec lequel les enzymes de restriction ne pourront plus interagir.

Exemple 3: Comprendre l’action des enzymes de restriction

Des échantillons d’ADN sont prélevés de deux organismes et chacun mélangés avec l’enzyme de restriction BamHI. L’enzyme de restriction coupe l’ADN de l’organisme A en trois parties, mais coupe l’ADN de l’organisme B en seulement deux parties. Qu’est-ce que cela suggère à propos de l’ADN des organismes ? 

1. L’organisme A possède moins de sites de reconnaissance BamHI dans son ADN que l’organisme B.
2. L’organisme A possède plus de sites de reconnaissance BamHI dans son ADN que l’organisme B.
3. L’ADN de l’organisme B est plus long que celui de l’organisme A.
4. L’échantillon prélevé de l’organisme B n’est pas mélangé avec suffisamment d’enzymes de restriction.

Réponse

BamHI est un exemple d’enzyme de restriction. Les enzymes de restriction, ou endonucléases, sont des enzymes qui coupent les molécules d’ADN sur des sites de reconnaissance spécifiques. Chaque enzyme de restriction a une séquence de reconnaissance différente.

Supposons que l’ADN des deux organismes est linéaire ; autrement dit il ne forme pas un cercle. Comme BamHI coupe l’ADN de l’organisme A en 3 fragments, ceci suggère que l’ADN de l’organisme A possède 2 sites de reconnaissance de BamHI. Et comme BamHI coupe l’ADN de l’organisme B en 2 fragments, ceci suggère que l’ADN de l’organisme B n’a qu’une seule séquence de reconnaissance. Regardez la figure suivante pour mieux visualiser.

Comme ces sites de reconnaissance sont aléatoires, nous pourrions affirmer que l’ADN de l’organisme A est plus long que celui de l’organisme B. En effet, une séquence d’ADN plus longue aura plus de chances de contenir d de reconnaissance BamHI. Cependant, cela suppose que les ADN entre les organismes A et B ont des proportions similaires de nucléotides A, G, C et T. Puisqu’aucune information supplémentaire ne nous est fournie pour donner une réponse définitive, l’option C n’est pas la meilleure option.

L’option D laisse entendre qu’il n’y a pas suffisamment d’enzymes de restriction pour effectuer la réaction. S’il n’y a pas assez d’enzymes de restriction, et que l’on ne laisse pas suffisamment de temps à la réaction pour qu’elle se déroule, alors cela pourrait être le cas. Cependant, la question concerne l’ADN des organismes, pas leurs conditions de réaction, donc l’option D est incorrecte.

Par conséquent, la bonne réponse est l’option B, l’organisme A a plus de sites de reconnaissance BamHI dans son ADN que l’organisme B.

La fonction des enzymes de restriction est très utile pour les bactéries, mais en quoi sont-elles bénéfiques pour nous, les humains ? Eh bien, elles nous permettent de couper l’ADN (n’importe quel ADN, pas seulement l’ADN viral) autour de régions très spécifiques qui nous intéressent. Et comme il existe tellement d’enzymes de restriction, il y a de fortes chances que nous puissions découper à peu près n'importe quel gène d’intérêt que nous voudrions étudier. Ou, en l’absence de séquences de reconnaissance, il est également possible de les fabriquer dans l’ADN.

Mais le but de tout ce découpage semble limité. Quel est l’intérêt de couper si nous ne pouvons pas rassembler les gènes d’une nouvelle manière intéressante ? Heureusement pour nous, les enzymes de restriction ont une autre propriété intéressante ; certaines d’entre elles peuvent produire ce que nous appelons des « extrémités cohésives » (ou extrémités collantes).

Les enzymes de restriction peuvent couper l’ADN de deux manières. Elles forment soit des extrémités cohésives, soit des extrémités franches (non cohésives).

Les extrémités cohésives que créent les enzymes de restriction en coupant l’ADN correspondent à des extrémités saillantes d’ADN qui sont « cohésives » les unes aux autres grâce à leurs paires de bases complémentaires, comme le montre la figure 5. C’est cette affinité que les bases ont l’une pour l’autre qui les rend « cohésives ».

Exemple 4: Reconnaître des extrémités cohésives

Le schéma fourni illustre un fragment d’ADN produit en découpant une séquence avec BamHI. Le fragment qui en résulte a des bases nucléotidiques exposées. Comment sont-elles appelées ? 

1. des extrémités libres
2. des extrémités actives
3. des extrémités cohésives
4. des extrémités ouvertes
5. des extrémités franches

Réponse

Les enzymes de restriction sont comme des ciseaux moléculaires qui coupent l’ADN en fragments. Elles sont capables de reconnaître des séquences spécifiques d’ADN appelées sites de reconnaissance (ou sites de restriction). Chaque enzyme de restriction a sa propre séquence de reconnaissance. Dans cet exemple, l’enzyme de restriction BamHI reconnaît la séquence GGATCC et coupe l’ADN comme indiqué.

L’ADN peut être coupé par des enzymes de restriction de deux manières différentes.

Une façon consiste à couper l’ADN pour laisser des extrémités saillantes d’ADN non appariées, à savoir des « extrémités cohésives ». On les appelle extrémités cohésives (ou collantes) parce que les bases ADN de chaque extrémité non appariée ont une affinité l’une pour l’autre selon les règles d’appariement des bases complémentaires. Ceci est illustré ci-dessous.

Une autre façon consiste à couper l’ADN en laissant une extrémité « franche » dans laquelle il n’y a pas d’extrémités saillantes, comme indiqué ci-dessous.

Étant donné que l’exemple de la question montre que l’ADN coupé laisse des extrémités saillantes, il s’agit d’une coupe à « extrémités cohésives ». Les extrémités cohésives peuvent servir à combiner des séquences d’ADN coupées de manière similaire pour former de nouvelles molécules d’ADN.

Par conséquent, la bonne réponse est l’option C, des extrémités cohésives.

En ce qui concerne les applications en biotechnologie, cette caractéristique des « extrémités cohésives » des enzymes de restriction peut être utilisée à notre avantage. L’ADN recombinant peut être créé en « coupant et en collant » de l’ADN provenant de plusieurs organismes qui partagent les mêmes extrémités cohésives. Leurs applications sont infinies ! 

Par exemple, supposons que nous étudions une nouvelle protéine chez une certaine espèce de poisson et que nous voulions savoir dans quelle partie du corps du poisson la protéine se situe. Avec des enzymes de restriction, nous pourrions créer un ADN recombinant en collant le gène d’une protéine fluorescente avec le gène d’une protéine de poisson. Ensuite, il n’y a plus qu’à regarder où la protéine du poisson est produite ! Ceci est illustré dans la figure 6.

Dans cet exemple, nous pouvons voir ci-dessous que cette protéine est localisée dans le cerveau du poisson, ce qui signifie que cette protéine pourrait avoir un impact sur les fonctions cérébrales.

Les enzymes de restriction peuvent couper l’ADN de deux manières. Les enzymes de restriction ne peuvent pas toutes produire des extrémités cohésives : certaines coupent leur site de reconnaissance de manière à ce qu’il n’y ait pas d’extrémités saillantes ou de séquence d’ADN non appariée. Celles-ci sont appelées des extrémités franches. Elles peuvent toujours être utilisées pour produire de l’ADN recombinant, mais elles ne sont pas aussi opérationnelles que lors de l’utilisation d’enzymes de restriction qui produisent des extrémités cohésives.

Exemple 5: Reconnaître les extrémités franches

Le mécanisme de Hpal est illustré dans le schéma ci-dessous. Quel est le terme donné aux extrémités générées par Hpal ? 

1. des extrémités ouvertes
2. des extrémités franches
3. des extrémités cohésives
4. des extrémités fermées
5. des extrémités courtes

Réponse

Les enzymes de restriction sont comme des ciseaux moléculaires qui coupent l’ADN en fragments. Elles sont capables de reconnaître des séquences spécifiques d’ADN appelées séquences de reconnaissance. Chaque enzyme de restriction a sa propre séquence de reconnaissance. Dans cet exemple, l’enzyme de restriction HpaI reconnaît la séquence GTTAAC et coupe l’ADN comme indiqué.

L’ADN peut être coupé par des enzymes de restriction de deux manières différentes.

Une façon consiste à couper l’ADN de sorte à laisser une extrémité « franche » dans laquelle il n’y a pas d’extrémités saillantes, comme indiqué ci-dessous.

L’autre façon est de couper l’ADN de sorte à laisser des d’extrémités saillantes de bases d’ADN non appariées, soit des extrémités « cohésives ». Elles sont appelées extrémités cohésives parce que les bases non appariées de l’ADN de chaque extrémité ont une affinité l’une pour l’autre selon les règles d’appariement des bases complémentaires. Ceci est illustré ci-dessous.

Étant donné que l’exemple de la question montre que l’ADN coupé ne laisse pas d’extrémités saillantes, il s’agit d’extrémités franches. Par conséquent, la bonne réponse est l’option B, des extrémités franches.

Récapitulons certains des points clés que nous avons abordés dans cette fiche explicative.