Fiche explicative de la leçon: Clonage de séquences d’ADN Biologie • Troisième année secondaire

Dans cette fiche explicative, nous allons apprendre à décrire le processus de création d’ADN recombinant en utilisant des vecteurs et à décrire comment la transcriptase inverse peut cloner des segments d’ADN.

L’une des plus grandes avancées scientifiques depuis les années 1970 est le développement de la technologie de l’ADN recombinant. L’ADN recombinant est un ADN composé de matériel génétique provenant d’au moins deux sources. L’ADN recombinant nous permet d’étudier les gènes plus en détail et de créer des combinaisons intéressantes de gènes utiles à l’Homme.

L’insuline est un excellent exemple de l’utilité de cette technologie. L’insuline est une protéine qui régule l’absorption du glucose par les cellules, utilisée comme médicament pour traiter les personnes atteintes de diabète. Avant le développement de la technologie de l’ADN recombinant, l’insuline était principalement extraite et purifiée des animaux (vaches ou porcs). Cependant, cela engendrait des problèmes, tels que le rejet immunitaire et des coûts très élevés. En assemblant l'ADN de l'insuline et l'ADN bactérien, il est devenu possible d'introduire cet ADN recombinant dans une bactérie et de le cultiver pour en faire de nombreuses copies. Ce faisant, nous avons pu produire de l’insuline humaine dans des bactéries en plus grande quantité et à moindre coût.

L'ADN recombinant est en soi une idée intéressante, mais pour qu'il soit utile, il faut pouvoir en faire de nombreuses copies. C’est là qu’intervient une technique de laboratoire appelée clonage de l’ADN. Un clone est une copie génétique d’un autre organisme, ou une copie de l’ADN.

Le clonage d’ADN est une technique qui nous permet de cloner ou de faire de nombreuses copies d’une séquence ADN ou d’un gène d’intérêt. Pour ce faire, la séquence d’ADN souhaitée est isolée et combinée avec un ADN vecteur, puis transférée dans des cellules hôtes appropriées (généralement des bactéries). À l'intérieur de ces bactéries, cet ADN recombinant se réplique pour faire de nombreuses copies de lui-même. Cela permet d’étudier la séquence plus en détail ou de fabriquer des protéines, comme dans le cas de l’insuline.

Afin de cloner l’ADN dans des bactéries, nous devons d’abord placer l'ADN sur un support spécialisé. C’est ce qu’on appelle un vecteur, un morceau d’ADN qui agit comme un véhicule pour transporter l’ADN dans une cellule. Le type de vecteur utilisé est appelé un plasmide.

Les plasmides ont été initialement découverts dans les bactéries et correspondent à de l’ADN circulaire non chromosomique qui porte des gènes de résistance aux antibiotiques (des gènes d’antibiorésistance). Ils peuvent être utilisés par les biologistes moléculaires pour introduire un ADN d’intérêt dans des cellules bactériennes.

Exemple 2: Comprendre les origines des plasmides dans le clonage de l’ADN

L'utilisation de plasmides pour former de l'ADN recombinant est indispensable au clonage de l'ADN.

Dans quels micro-organismes les plasmides ont-ils été découverts à l’origine ? 

1. les virus
2. les champignons
3. les protistes
4. les bactéries
5. les algues

Réponse

L’ADN recombinant est un ADN composé de matériel génétique provenant d’au moins deux sources.

Pour utiliser efficacement l'ADN recombinant, nous devons en produire beaucoup. Pour ce faire, on utilise une technique appelée clonage d’ADN, qui nous permet de faire de nombreuses copies d’une séquence d’ADN souhaitée. Premièrement, la séquence d’ADN souhaitée doit être isolée et combinée avec un support d’ADN appelé un plasmide. Les plasmides sont des morceaux d’ADN circulaires non chromosomiques, dont certains peuvent contenir des gènes de résistance aux antibiotiques. Ils ont été découverts à l’origine dans des bactéries.

Les plasmides permettent de transporter l’ADN dans des bactéries. En fabriquant de l’ADN recombinant avec la séquence d’ADN souhaitée et l’ADN plasmidique, il est possible de transférer cet ADN dans des bactéries pour cloner la séquence d’ADN souhaitée.

Par conséquent, la seule réponse possible à cette question est l’option D, les bactéries.

Les plasmides peuvent être excisés en utilisant des enzymes de restriction pour insérer une séquence ADN d’intérêt. L’excision de la séquence d'ADN et du plasmide avec la même enzyme de restriction produit des extrémités cohésives compatibles qui peuvent s'assembler. Vous vous souvenez peut-être que les extrémités cohésives sont produites lorsque l'ADN est excisé avec une enzyme de restriction qui laisse en porte-à-faux des bases non appariées ayant une affinité l'une pour l'autre selon les règles d'appariement des bases complémentaires. Vous pouvez le voir dans la figure 1.

Dans la figure 1, il y a deux extrémités cohésives complémentaires, qui peuvent s’unir grâce à leurs paires de bases complémentaires. Cependant, cette association est faible puisqu’elle ne dépend que de la liaison hydrogène des nucléotides, il faut donc quelque chose de plus permanent.

Une enzyme appelée ADN ligase peut lier ces deux extrémités cohésives ensemble, dans un processus appelé ligature. Cette enzyme peut reformer la liaison phosphodiester qui a été rompue par l’enzyme de restriction, pour rétablir les lacunes dans le squelette sucre-phosphate. Ce processus est illustré dans la figure 2.

Les figures 1 et 2 montrent une partie de l'ADN d'intérêt et le plasmide. Les mêmes étapes se déroulent aussi de l'autre côté afin que le fragment entier de l'ADN souhaité soit ligaturé dans un plasmide. Le processus global est résumé dans la figure 3.

Exemple 3: Comprendre l’importance des extrémités cohésives complémentaires dans le clonage de l’ADN

Lors de la formation de l’ADN recombinant, pourquoi est-il important que le segment souhaité de l’ADN et le plasmide bactérien soient excisés en utilisant la même enzyme de restriction ? 

1. afin de laisser des extrémités cohésives complémentaires
2. afin de réduire la probabilité que la bactérie rejette l’ADN
3. afin de laisser des extrémités franches non complémentaires
4. afin que l’ADN et le plasmide soient de même taille
5. afin d’économiser de l’argent

Réponse

L’ADN recombinant est un ADN composé de matériel génétique provenant de plusieurs sources.

Afin d’utiliser efficacement l’ADN recombinant, nous devons en fabriquer beaucoup. Pour ce faire, une technique appelée clonage de l'ADN crée de nombreuses copies d'une séquence d'ADN souhaitée. Tout d'abord, la séquence ADN souhaitée doit être isolée et combinée avec une séquence d'ADN d’un vecteur appelé plasmide.

Pour combiner le plasmide avec la séquence ADN souhaitée, on utilise des enzymes de restriction. Il s'agit d'enzymes qui peuvent exciser l'ADN au niveau de séquences de reconnaissance spécifiques afin de laisser des extrémités cohésives ou franches. Les extrémités cohésives sont adhésives parce qu’elles ont une affinité l'une pour l'autre selon les règles d'appariement des bases complémentaires, et ne se collent donc que si la même enzyme de restriction a été utilisée. Prenons l'exemple suivant d'un segment d'ADN excisé à l'aide de l'enzyme de restriction BamHI (qui reconnaît la séquence GGATCC).

Dans cet exemple, nous constatons qu’en coupant les deux séquences avec BamHI, nous pouvons générer des extrémités cohésives compatibles et capables de se rejoindre. Si nous utilisons différentes enzymes de restriction, les extrémités cohésives générées seront différentes, et donc non compatibles.

En fabriquant de l'ADN recombinant avec la séquence d'ADN souhaitée et l'ADN plasmidique, il est possible de transférer cet ADN à l'intérieur de bactéries pour cloner la séquence d'ADN souhaitée.

Par conséquent, la bonne réponse est l’option A, afin de laisser des extrémités cohésives complémentaires.

Une fois l’ADN recombinant réalisé, il peut ensuite être inséré dans des bactéries par le biais d’un processus appelé transformation. Elle consiste à rendre perméables les bactéries en les exposant à des ions calcium et à des températures élevées, ce qui permet à l'ADN recombinant de traverser la membrane cellulaire et de pénétrer dans le cytoplasme de la bactérie.

Une fois que l’ADN recombinant est à l’intérieur de la bactérie, il est répliqué pour faire davantage de copies. Il peut également être transcrit et traduit en la protéine correspondante. Par exemple, si le gène de l'insuline est cloné dans un plasmide puis transformé dans une bactérie, nous pouvons extraire la protéine insuline à partir des bactéries, comme le montre la figure 4. Le clonage de l’ADN a révolutionné la façon dont l’insuline est produite.

Il existe de nombreuses autres applications du clonage ADN.

Pour lutter contre les virus, les chercheurs ont isolé et cloné des gènes codant pour les interférons. Ce sont des protéines spéciales qui peuvent interférer avec la réplication des virus (en particulier les virus avec des génomes ARN, comme le virus influenza). À l’intérieur de l’organisme, les cellules infectées par un virus libèrent des interférons afin de se défendre et de protéger les cellules voisines. Dans les années 1970, l’interféron a été extrait des cellules humaines à des fins médicales. Cependant, ce processus était très coûteux. Dans les années 80, 15 gènes différents des interférons ont été clonés dans des bactéries pour fabriquer des interférons à un coût beaucoup plus raisonnable. Les interférons peuvent également être utilisés pour traiter le cancer.

En agriculture, les chercheurs ont cloné des gènes de résistance aux parasites des cultures. Cela a permis aux agriculteurs de cultiver de la nourriture sans pulvériser des pesticides qui sont coûteux et potentiellement toxiques pour l’environnement. Les gènes qui permettent aux plantes d'héberger des bactéries fixatrices d’azote dans leurs racines sont également bénéfiques, car ils éliminent le besoin d’engrais azotés.

L’ADN des mouches à fruit a été manipulé pour montrer que ces modifications génétiques peuvent être transmises à la progéniture. Dans une expérience, un gène pour la couleur des yeux rouges a été inséré dans des embryons de mouches à fruit, dont la progéniture a également hérité du gène de la couleur des yeux rouges.

Des gènes ont également été clonés chez des mammifères. Chez la souris, les chercheurs ont cloné le gène humain de l'hormone de croissance, ce qui a conduit les souris à doubler de taille.

L’univers du clonage ADN est très excitant, mais il soulève néanmoins des inquiétudes chez certaines personnes. Supposons qu’une souche bactérienne qui produit une toxine mortelle soit libérée dans le monde. Ces inquiétudes ne sont cependant pas réalistes, car de nombreuses précautions sont prises et les bactéries sont incapables de survivre en dehors des conditions optimales du laboratoire.

Maintenant, voyons comment isoler notre ADN d’intérêt pour pouvoir le cloner dans un plasmide. Rappelez-vous que l’ARNm peut être transcrit à partir d’ADN, et peut ensuite être traduit en une protéine.

Nous pouvons isoler des cellules qui produisent une protéine particulière en grande quantité, par exemple les cellules bêta du pancréas qui produisent l'insuline, puis extraire l'ARNm de cette protéine à partir de ces cellules. Mais l’ARNm doit lui-même d’abord être converti en ADN si nous voulons le cloner dans des bactéries (car les enzymes de restriction ne reconnaissent que l’ADN double brin).

Le processus de conversion de l’ARNm en ADN est appelé transcription inverse, et l’enzyme responsable de cette conversion est appelée transcriptase inverse (ou rétrotranscriptase).

Cette enzyme utilise l’ARNm comme matrice pour fabriquer un brin complémentaire d’ADN appelé ADNc. L’ADNc est un ADN simple brin. La formation de l'ADNc repose sur les règles d'appariement des bases complémentaires (où A s'apparie avec T et G s'apparie avec C), sauf qu'il faut tenir compte de l'uracile (U) qui remplace la thymine (T) dans l'ARN et s'apparie avec l'adénine (A). Vous pouvez voir comment l’ADNc est synthétisé dans la figure 5.

Cependant, fabriquer de l’ADNc n’est pas suffisant. Comme il s’agit d’une molécule simple brin, nous avons besoin d’un moyen pour la convertir en une molécule d’ADN double brin. L’enzyme qui peut le faire est appelée ADN polymérase. Il s’agit d’une enzyme qui transforme l’ADN simple brin en un ADN double brin, et qui est également responsable de la réplication de l’ADN dans nos cellules. Vous pouvez le voir dans la figure 6.

Exemple 5: Comprendre le rôle de la transcriptase inverse et l’ADN polymérase dans le clonage de l’ADN

Le schéma ci-dessous montre comment l’enzyme transcriptase inverse peut cloner un segment de matériel génétique. Quel est le rôle de l’ADN polymérase dans ce processus ? 

1. Former un brin d’ADN complémentaire à l’ADNc.
2. Servir de site pour la synthèse du brin d’ADNc.
3. Combler les lacunes dans le squelette sucre-phosphate des molécules d’ARNm et d’ADNc.
4. Former un brin d’ADNc qui est complémentaire à l’ARNm.
5. Rompre les liaisons hydrogène entre les paires de bases complémentaires

Réponse

Le clonage de l’ADN est une technique qui nous permet de cloner ou de faire de nombreuses copies d’une séquence d’ADN ou d’un gène d’intérêt. Pour ce faire, la séquence ADN souhaitée est isolée et combinée avec l'ADN du vecteur, puis transférée dans des cellules hôtes appropriées (généralement des bactéries). À l'intérieur de ces bactéries, cet ADN recombinant se réplique pour faire de nombreuses copies de lui-même. Cela permet d’étudier la séquence de façon plus approfondie ou de fabriquer des protéines.

Une façon d’isoler une séquence ADN pour le clonage est de convertir l’ARNm correspondant en ADN. Vous vous souviendrez peut-être que l’ARNm peut être transcrit à partir d’ADN, et peut ensuite être traduit en une protéine. L’ARNm doit lui-même d’abord être converti en ADN pour pouvoir être cloné dans des bactéries. Le processus de conversion de l’ARNm en ADN est appelé transcription inverse. L’enzyme responsable de cette conversion est appelée transcriptase inverse.

Cette enzyme utilise l’ARNm comme matrice pour fabriquer un brin complémentaire d’ADN appelé ADNc. L’ADNc est un ADN simple brin qui doit être converti en ADN double brin pour le clonage de l’ADN. L’enzyme qui s’en charge est l’ADN polymérase, qui peut utiliser l’ADNc comme matrice pour former un autre brin complémentaire d’ADN afin de produire une molécule d’ADN double brin.

Examinons les réponses possibles. L’option A semble être un bon choix car c’est ce que fait l’ADN polymérase. L’option B ne décrit pas ce que fait l’ADN polymérase. L’option C décrit l’activité de l’ADN ligase et non celle de l’ADN polymérase. L’option D décrit l’activité de la transcriptase inverse et non celle de l’ADN polymérase. L’option E ne décrit pas ce que fait l’ADN polymérase.

Par conséquent, la réponse correcte est l’option A, de former un brin d’ADN qui est complémentaire à l’ADNc.

Une fois que l'ADNc est converti en ADN double brin, il peut être traité par une enzyme de restriction qui ne reconnaît que l'ADN double brin, c’est pourquoi nous nous sommes donnés tout ce mal. Après cette étape, l’ADN est prêt à être cloné.

Récapitulons le processus de conversion de l’ARNm en ADN double brin : 

1. L’ARNm d’un gène est isolé.
2. L’ARNm est converti en ADNc par la transcriptase inverse.
3. L’ADNc est transformé en ADN double brin par une ADN polymérase.
4. L’ADN double brin peut être utilisé pour le clonage de l’ADN.

La figure 7 résume l’ensemble du processus.

Il existe d’autres façons d’isoler un gène d’intérêt. L’une d’entre elles consiste à utiliser la réaction en chaîne par polymérase (PCR), une technique spécialisée pour amplifier des séquences d’ADN spécifiques à l’aide d’une enzyme appelée Taq polymérase. Alors que le clonage nécessite la multiplication de bactéries pour copier l'ADN recombinant, la PCR peut être effectuée dans un tube de laboratoire sans utiliser de bactéries. En effet, la PCR fait de multiples copies, ou amplifie, une séquence d’ADN cible.

Récapitulons certains des points clés que nous avons abordés dans cette fiche explicative.