Dans cette fiche explicative, nous allons apprendre à comparer et à opposer les différents types de microscope et à identifier le type de microscope utilisé par l’image qu’il produit.
Les microscopes fonctionnent comme une paire de lunettes très puissantes, à travers lesquels nous pouvons voir n’importe quoi, de la structure détaillée de la surface des matériaux et de la structure interne des cellules, jusqu’aux minuscules organismes vivants, tels que les bactéries, qui seraient autrement invisibles à l’œil nu. Les premiers microscopes étaient en fait appelés des « lunettes à puces », car ils étaient utilisés pour étudier les petits insectes. Depuis, les microscopes sont devenus plus puissants et plus sophistiqués, et nous font voir le monde microscopique vivant autour de nous.
Les microscopes produisent un grossissement, ce qui signifie qu’un échantillon agrandi semblera 100 fois plus large et 100 fois plus long qu’il ne l’est en réalité.
Définition : Grossissement
Le grossissement est le nombre de fois où une image apparaît plus grande que l’objet original.
Examinons les différentes parties d’un microscope optique dans la figure suivante, afin de mieux comprendre leur fonctionnement.
Les microscopes optiques composés sont constitués généralement de deux lentilles, qui sont des feuilles de verre transparentes et petites mais épaisses. Ces lentilles concentrent la lumière qui traverse l’objet pour former l’image que vous souhaitez voir dans votre œil. Vous pouvez voir un exemple d’objectif sur la photo ci-dessous.
La lentille de l’oculaire est située en haut du microscope. On l’appelle « oculaire », car c’est la partie à travers laquelle notre œil regarde.
Terme clé : Oculaire
L’oculaire est la partie du microscope à travers laquelle l’observateur regarde. Il contient la lentille de l’oculaire, qui est la lentille la plus proche de l’œil de l’observateur. On l’appelle parfois la lentille oculaire (oculaire se référant à l’œil ou à la vision).
En dessous de l’oculaire se trouvent les objectifs du microscope. Ces lentilles sont appelées des « objectifs » car ce sont celles qui sont les plus proches de l’objet observé. La plupart des microscopes ont plusieurs objectifs, qui ont différents grossissements. Ces lentilles peuvent être changées en fonction du grossissement souhaité de l’échantillon ou de la lame. Par exemple, si vous souhaitez utiliser l’objectif , vous pouvez déplacer cet objectif jusqu’à ce qu’il soit aligné avec l’oculaire.
Terme clé : Objectifs
Les objectifs sont les lentilles les plus proches de l’objet observé au microscope.
Ces deux lentilles convergent la lumière pour former une image visible qui est plus grande que l’objet en lui-même, dont le principe de base est expliqué sur la figure suivante. Le passage de la lumière à travers ces lentilles produit une image agrandie dans l’œil de l’observateur.
Sous les lentilles des objectifs se trouve la platine, une large surface plate sur laquelle on peut placer une lame fixée par des valets. Les lames sont des morceaux de verre rectangulaires sur lesquels un échantillon est placé.
Terme clé : Échantillon
Un échantillon est un ensemble ou une partie d’un organisme qui a été collecté et conservé pour être exposé, analysé ou étudié.
Pour que la vue de l’échantillon ne soit pas floue, vous pouvez utiliser les vis de mise au point sur le côté du microscope pour rendre votre image plus nette. Lorsque vous placez une lame sur l’étage inférieur sans réglages et que vous regardez à travers l’oculaire, l’image apparaîtra probablement floue au début. Tout en regardant à travers l’oculaire, tournez le bouton le plus large, appelé la vis de mise au point macrométrique, pour rendre l’image plus nette. Lorsque l’image devient nette, tournez le bouton le plus petit, ou la vis de mise au point micrométrique, pour que les détails les plus fins de votre échantillon deviennent visibles.
Comment utiliser un microscope optique pour observer une lame
- Lors de l’utilisation d’un microscope optique, commencer par le grossissement le plus faible possible en sélectionnant l’objectif et en le tournant jusqu’à ce qu’il s’enclenche au-dessus de l’étage inférieur.
- Mettre l’échantillon sur une lame, puis placer la lame sur la platine en la fixant par des valets.
- Ajuster l’emplacement de la lame si nécessaire pour s’assurer que l’échantillon est directement sous la lentille de l’objectif.
- Regarder à travers l’oculaire comme indiqué sur la photo.
- Ajuster la vis de mise au point macrométrique (le bouton le plus grand) comme indiqué sur la photo jusqu’à ce que l’image devienne plus nette. > Cette vis est utilisée pour une mise au point grossière.
- Déplacer la lame si nécessaire pour observer la zone souhaitée de l’échantillon.
- Ajuster avec le bouton de mise au point micrométrique (le plus petit) jusqu’à ce que l’image devienne aussi nette que possible. Cette vis est utilisée pour une mise au point plus précise.
- Augmenter le grossissement si nécessaire en sélectionnant l’objectif le plus élevé (généralement ) et en le tournant jusqu’à ce qu’il s’enclenche juste au-dessus de la lame.
- Répéter les étapes 4, 5 et 7 pour améliorer la mise au point sur votre image et, si nécessaire, pour augmenter à nouveau le grossissement.
Terme clé : Pouvoir grossissant total (Grossissement total)
Le pouvoir grossissant total correspond à la capacité combinée de l’oculaire et des objectifs d’un microscope à produire une image plus grande que l’objet lui-même.
Bien que le grossissement de la lentille de l’oculaire reste le même, l’objectif que vous choisissez d’utiliser détermine le grossissement global de l’image que vous verrez. Pour calculer le grossissement total de l’image que nous regardons, nous multiplions le grossissement de la lentille de l’oculaire (généralement ) par celui de la lentille de l’objectif utilisée. Par exemple, si nous regardions un échantillon en utilisant l’objectif à puissance la plus faible (), notre grossissement total serait 10 (le grossissement de la lentille de l’oculaire) multiplié par 10 (le grossissement de la lentille de l’objectif). Ainsi, le pouvoir grossissant total de notre microscope, et le nombre de fois que l’image de l’objet est agrandie, est .
Voici une équation simple qui peut être utilisée pour calculer le pouvoir grossissant total d’un microscope optique.
Formule: Calculer le grossissement total
Exemple 1: Définir le grossissement
Laquelle des affirmations suivantes définit le mieux le grossissement ?
- Le grossissement est calculé comme la puissance de la lentille de l’objectif divisée par la puissance de la lentille de l’oculaire.
- Le grossissement est le nombre de structures différentes pouvant être identifiées dans une image.
- Le grossissement est la distance minimale à laquelle deux objets doivent se trouver l’un de l’autre pour qu’ils apparaissent comme des éléments distincts.
- Le grossissement est le nombre de fois que l’image apparait plus grande que l’objet réel.
Réponse
Nous devons faire attention aux questions demandant la « meilleure » définition, car même si ce sont des questions à choix multiples, elles ne sont pas évidentes, car plus d’une réponse peuvent sembler correctes.
À chaque fois que le mot « agrandir » est utilisé, c’est toujours pour faire référence à quelque chose qui est plus grand que ce qu’il est. Par exemple, « grossir » ou « agrandir » l’écran d’un ordinateur fait allusion au fait de zoomer sur une image ou un texte, tout comme une loupe fait paraître les petits objets plus grands. Cela suggère que la réponse est l’option D. Cependant, comme nous cherchons la meilleure définition, vous devez vous assurer que les autres ne sont pas mieux. Nous pouvons analyser la plupart des questions à choix multiples par élimination.
L’option A nous indique (incorrectement) comment calculer le pouvoir grossissant total ou le grossissement total d’un microscope, mais elle ne se réfère pas à la définition même du grossissement. Si vous remarquez qu’un calcul est faux, c’est une bonne façon d’éliminer une option dans une question à choix multiple.
L’option B correspond à la résolution, car le nombre de différentes structures identifiables dans une image dépend de la facilité avec laquelle les différents objets peuvent être résolus ou distingués les uns des autres. Bien que le grossissement d’une structure puisse la distinguer d’autres objets, cette affirmation ne mentionne pas le but clé du grossissement, à savoir qu’il rend les objets plus grands qu’ils ne le sont réellement.
En rappelant la définition du grossissement comme n’étant pas le degré auquel les structures peuvent être distinguées les unes des autres, nous pouvons éliminer l’option C.
Notre réponse correcte est donc l’option D. Le grossissement est le nombre de fois que l’image apparait plus grande que l’objet réel.
Les microscopes optiques sont uniques, car les échantillons, vivants ou morts, peuvent être colorés pour produire des images en couleur. Ces microscopes sont souvent utilisés en biologie pour observer les tissus et faire la distinction entre les cellules individuelles, ainsi que certains de leurs plus grands organites, tels que le noyau. Ils produisent toujours des images planes en deux dimensions (2D).
Pour distinguer plus facilement les cellules ou les structures d’une cellule ou d’un échantillon, des colorants et des teintures peuvent être appliqués à l’échantillon avant de le placer au microscope optique. Les teintures et les colorants sont absorbés à différents degrés par les différents constituants cellulaires. Cela augmente le contraste entre les différents constituants, ce qui les rend plus faciles à identifier.
Par exemple, le bleu de méthylène se lie aux constituants cellulaires chargés négativement dans le cytoplasme ou le noyau. D’autre part, le rouge Congo est repoussé par le cytoplasme chargé négativement et ne colore généralement pas les cellules, mais plutôt les structures extracellulaires entourant les cellules, ce qui rend les cellules plus faciles à distinguer. Le rouge Congo peut aussi colorer les parois cellulaires d’organismes comme les plantes et les champignons, ou les membranes de certaines bactéries. Les colorations multiples sont souvent utilisées pour distinguer et identifier un mélange de constituants, tels que différentes espèces de bactéries. Ce processus est appelé la coloration différentielle.
Les deux images suivantes sont des exemples de micrographies montrant que la coloration permet de visualiser certains constituants cellulaires. Les micrographies sont des photographies d’une structure agrandie réalisées à l’aide d’un microscope. Ces micrographies ont été produites à l’aide d’un microscope optique.
L’image ci-dessus est une micrographie réalisée grâce à un microscope optique montrant des neurones et des cellules gliales de tissu cérébral humain. Elle a été obtenue par la technique de coloration de Nissl et la coloration au bleu de toluidine, qui sont souvent utilisées pour des échantillons de tissus nerveux car elles colorent les acides nucléiques dans les noyaux des cellules.
L’image ci-dessus est une micrographie de cellules hépatiques (hépatocytes) réalisée avec un microscope optique. Dans cet échantillon, une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) a été utilisée, où l’hématoxyline colore les noyaux de couleur bleu violacé et l’éosine colore la matrice extracellulaire et le cytoplasme en rose.
La résolution est la distance minimale entre deux objets qui permet de les voir séparés. Plus les objets sont petits, plus il est difficile de les distinguer les uns des autres. Par conséquent, lorsque des objets minuscules sont visualisés au microscope, nous avons besoin d’un pouvoir de résolution élevé, car ils seront à une très petite distance les uns des autres.
Terme clé : Résolution
La résolution d’un dispositif optique est la distance minimale entre deux objets adjacents à laquelle ils peuvent être distingués visuellement.
Pour comprendre la résolution à l’échelle microscopique, prenons d’abord un exemple à notre échelle. La nuit, si une voiture au loin vient vers vous, vous ne verrez qu’une lumière s’approcher. Cependant, lorsque la voiture se rapproche, cette lumière unique se transforme en deux lumières distinctes provenant de chaque phare. À mesure que la voiture approche, les lumières apparaissent plus éloignées l’une de l’autre que lorsqu’elles étaient plus loin, le pouvoir de résolution de nos yeux peut donc distinguer les deux sources de lumière l’une de l’autre.
L’un des facteurs affectant la résolution est la longueur d’onde de la source d’éclairage utilisée. Les meilleurs microscopes optiques peuvent avoir une résolution des images allant jusqu’à environ 200 nm (0,0002 mm), ce qui est partiellement limité par la longueur d’onde de la lumière (la source d’éclairage).
Regardons la figure 6 pour voir comment cela fonctionne.
Dans l’image supérieure de la figure 6, vous pouvez voir que la lumière a une longueur d’onde assez grande et que ces deux objets ne peuvent pas être distingués l’un de l’autre. Ils sont trop proches l’un de l’autre et, par conséquent, ne respectent pas la distance minimale entre deux objets pour la longueur d’onde de cette source d’éclairage.
L’image du bas sur la figure 6 montre une source d’éclairage avec une longueur d’onde plus petite, par exemple, dans un microscope utilisant des électrons à la place de la lumière. Cela se traduit par une résolution plus élevée qui est donc meilleure, permettant aux deux mêmes objets d’être distingués l’un de l’autre. Plus la longueur d’onde de la lumière est grande, plus la résolution est mauvaise (faible).
Alors que la lumière a une grande longueur d’onde, et que les appareils qui l’utilisent, tels que les microscopes, ont une faible résolution généralement autour de 200 nm, certains microscopes optiques possèdent des lentilles spéciales qui donnent une résolution des objets inférieure à 100 nm. Les électrons ont une longueur d’onde significativement plus petite que celle de la lumière et ont donc un pouvoir de résolution bien meilleur, permettant à des objets qui sont à une distance minuscule de paraître encore séparés.
Il existe deux types principaux de microscopes électroniques : un microscope électronique en transmission (MET) et un microscope électronique à balayage (MEB).
Exemple 2: Définir la résolution
Laquelle des affirmations suivantes définit le mieux la résolution ?
- La résolution est le nombre de structures différentes pouvant être identifiées dans une image.
- La résolution est calculée comme étant le pouvoir grossissant de l’objectif divisé par le pouvoir grossissant de l’oculaire.
- La résolution est le nombre de fois que l’image est plus grande que l’objet réel.
- La résolution est la distance minimale à laquelle deux objets doivent être séparés pour qu’ils apparaissent comme des éléments distincts.
Réponse
Nous devons faire attention aux questions demandant la « meilleure » définition, car même si ce sont des questions à choix multiples, elles ne sont pas évidentes, car plus d’une réponse peuvent sembler correctes. Nous pouvons résoudre la plupart des questions à choix multiples par élimination.
Bien que l’option A soit techniquement correcte en affirmant que davantage de structures peuvent être identifiées lorsque la résolution est meilleure, elle ne mentionne pas les deux points clés qui définissent le mot « résolution » : il s’agit d’une mesure de la distance et elle nécessite que les objets soient séparés ou distincts les uns des autres. Pour vous aider à vous en souvenir, pensez toujours aux unités d’un terme, si celui-ci en possède. L’unité de résolution s’exprime généralement en nanomètres (nm), ce qui correspond à une mesure de la distance, et par conséquent, notre réponse devrait se référer à la distance entre deux objets.
L’option B nous indique (incorrectement) comment calculer le pouvoir grossissant ou le grossissement total d’un microscope. Donc, celui-ci fait référence au grossissement et non à la résolution et peut donc être également écarté de nos choix. Si vous remarquez qu’un calcul est faux, c’est une bonne façon d’éliminer une option dans une question à choix multiple.
En rappelant notre définition du grossissement, c’est-à-dire le nombre de fois qu’une image est plus grande que l’objet réel, nous pouvons éliminer l’option C.
L’option D est donc la meilleure réponse, car elle indique la distance minimale à laquelle les structures doivent se trouver pour paraître distinctes.
Par conséquent, la bonne réponse est que la résolution correspond à la distance minimale à laquelle deux objets doivent être séparés pour qu’ils apparaissent comme des éléments distincts.
Les deux types de microscopes électroniques produisent des images en noir et blanc, bien qu’il soit possible d’ajouter des couleurs après la production de la micrographie. Ils ont tous deux un grossissement beaucoup plus élevé que celui des microscopes optiques (MET : supérieur à ; MEB : ). Leur pouvoir de résolution est également meilleur, puiqu’ils peuvent distinguer des objets beaucoup plus petits comme étant séparés les uns des autres avec une résolution maximale typique de 0,5 nm pour le MEB et 0,05 nm pour le MET. Alors que les MET produisent des images 2D, souvent utilisées pour voir des organites à l’intérieur d’une cellule avec beaucoup de détails, les MEB produisent des images 3D détaillées de la surface d’un échantillon.
Les échantillons préparés pour la microscopie électronique sont généralement morts. Si un échantillon vivant est soumis à un faisceau d’électrons, il est certain qu’il n’y survivra pas, donc seuls les échantillons morts sont utilisés pour la microscopie électronique.
Termes clés : Microscope électronique en transmission (MET)
Un microscope électronique en transmission transmet un faisceau d’électrons focalisé à travers un échantillon à l’aide d’électroaimants, ce qui produit une image 2D détaillée en noir et blanc des structures internes d’une cellule ou d’un échantillon.
Voici quelques exemples de micrographies réalisées avec un microscope électronique en transmission (MET).
L’image ci-dessus est une micrographie MET montrant une cellule reproductrice femelle immature (ovogonie). Le nucléole ressort en noir, et les mitochondries et gouttelettes lipidiques peuvent être observées dans le cytoplasme.
L’image ci-dessus est une micrographie MET éditée en couleur montrant le cytoplasme (bleu), et l’enveloppe nucléaire autour du noyau (or) attachée au réticulum endoplasmique rugueux (rouge).
Termes clés : Microscope électronique à balayage (MEB)
Un microscope électronique à balayage émet un faisceau d’électrons à la surface d’un échantillon qui est recouvert d’ions métalliques (p. ex., de l’or). Ces ions réfléchissent les électrons, qui sont ensuite captés pour produire une image 3D en noir et blanc très détaillée de la surface de l’échantillon.
Voyons quelques exemples de micrographies produites par un microscope électronique à balayage (MEB).
L’image ci-dessus est une micrographie MEB d’un parasite de l’abeille Varroa destructor agrandi .
L’image ci-dessus est une micrographie MEB du virus Ebola.
Exemple 3: Identifier le microscopes utilisé pour produire la micrographie
La micrographie fournie est celle d’une tête de fourmi. Avec quel type de microscope cette image a t-elle été produite ?
- le microscope optique
- le microscope électronique en transmission
- le microscope électronique à balayage
Réponse
Cette image est en 3D et montre la surface extérieure d’une partie très agrandie d’un organisme qui semble être mort.
Puisque cette image est en 3D, les microscopes optiques et les microscopes électroniques en transmission peuvent être éliminés, ce qui suggère que l’image a été produite par un microscope électronique à balayage. Non seulement un microscope électronique à balayage produit des micrographies avec un fort grossissement et une haute résolution, mais il produit aussi des images en 3D qui montrent la surface de l’échantillon.
Comme cette micrographie présente une surface externe hautement agrandie et résolue en 3D, nous pouvons conclure que cette image a été produite par un microscope électronique à balayage.
Il est utile de comparer des microscopes à l’aide d’un tableau. Regardons le tableau suivant qui compare le pouvoir grossissant, la résolution, l’image produite et le mécanisme de la lumière entre les microscopes électroniques à balayage et en transmission.
Tableau 1: Comparaison entre les caractéristiques des microscopes optiques et électroniques, notamment leur grossissement et leur résolution maximum, le type d’images qu’ils produisent et leur fonctionnement.
| Microscope | Grossissement maximal | Résolution typique maximale (nm) | Quelle sorte d’image produit-il ? | Comment fonctionne-t-il ? |
|---|---|---|---|---|
| Optique | 200 | Des images 2D en couleurs, permettant de différencier les cellules d’un tissu ou les organites basiques et les grands organites d’une cellule. | Fonctionne à l’aide de lentilles pour focaliser un faisceau de lumière traversant un échantillon. | |
| SEM | 0,5 | Images 3D très détaillées en noir et blanc de la surface extérieure de la cellule ou de l’échantillon, comme les virus ou bactéries | Les échantillons sont recouverts d’ions métalliques (p. ex. l’or), et les électrons transmis sur la surface sont réfléchis et détectés pour produire une image 3D de l’échantillon. | |
| TEM | Plus que | 0,05 | Images 2D très détaillées en noir et blanc le plus souvent de l’ultrastructure de la cellule et des organites. | Un faisceau d’électrons est focalisé à l’aide d’un électroaimant, puis transmis à travers le spécimen pour atteindre un détecteur à l’autre extrémité. |
Exemple 4: Comparer la résolution, le grossissement et le type d’image produite par différents microscopes
Lequel des tableaux suivants compare correctement les microscopes optiques, les microscopes électroniques à balayage et ceux en transmission ?
Type de microscope Résolution maximale classique (nm) Grossissement maximal classique Image produite Optique 0,5 2D, couleur Électronique à balayage 200 3D, noir et blanc Électronique en transmission 200 2D, noir et blanc Type de microscope Résolution maximale classique (nm) Grossissement maximal classique Image produite Optique 200 2D, couleur Électronique à balayage 0,5 3D, noir et blanc Électronique en transmission 0,05 2D, noir et blanc Type de microscope Résolution maximale classique (nm) Grossissement maximal classique Image produite Optique 200 2D, noir et blanc Électronique à balayage 0,1 3D, couleur Électronique en transmission 0,1 2D, noir et blanc Type de Microscope Résolution maximale classique (nm) Grossissement maximal classique Image produite Électronique à balayage 200 2D, couleur Électronique en transmission 200 3D, noir et blanc Optique 200 2D, noir et blanc
Réponse
Une question comme celle-ci peut se résoudre par élimination.
Tout d’abord, regardons le type d’image produite dans chaque exemple.
Nous savons que seuls les microscopes optiques peuvent produire des images en couleur, ce qui nous permet d’éliminer l’option C qui stipule que les microscopes électroniques à balayage produisent des images en couleur. Nous savons également que seuls les microscopes électroniques à balayage peuvent produire des images 3D, ce qui nous permet d’éliminer l’option D qui indique que les microscopes électroniques en transmission produisent des images 3D et que les microscopes électroniques à balayage ne le font pas.
Il nous reste les options A et B, alors regardons la résolution maximale et le grossissement. Le grossissement à lui seul nous donne notre réponse et est généralement le plus facile à retenir. Les microscopes optiques ont toujours le grossissement le plus faible, , par rapport aux microscopes électroniques, qui ont un grossissement de pour un MEB et pour un MET. D’après les grossissements, l’option A nous indique que les MET ont un grossissement inférieur à celui des microscopes optiques et représente donc une mauvaise réponse, ce qui nous laisse avec B comme dernière option possible.
Vérifions notre réponse en regardant la colonne de résolution maximale. Les microscopes électroniques peuvent avoir une résolution des objets beaucoup plus petite que celle des microscopes optiques. Cela confirme que l’option B est le bon choix, car A indique que les microscopes optiques ont une résolution des objets relativement plus petite, ce qui est faux.
Cela peut prêter à confusion, car plus un microscope a une grande capacité de résolution des petits objets les distingant les uns des autres, plus la valeur de la résolution maximale sera faible. En effet, si la résolution maximale représente la plus petite distance possible entre deux objets à laquelle ils sont distingués l’un de l’autre, alors plus la valeur est petite, meilleure sera la résolution.
Ainsi, notre réponse correcte est la suivante.
| Type de microscope | Résolution maximale classique (nm) | Grossissement maximal classique | Image produite |
|---|---|---|---|
| Optique | 200 | 2D, couleur | |
| Électronique à balayage | 0,5 | 3D, noir et blanc | |
| Électronique en transmission | 0,05 | 2D, noir et blanc |
Points clés
- Les microscopes optiques produisent des images couleurs 2D et distinguent généralement les cellules dans les tissus.
- La coloration différentielle est l’utilisation de différentes teintures et colorants au microscope optique pour faire la distinction entre les constituants d’échantillons vivants ou morts.
- Les microscopes électroniques produisent des images en noir et blanc, qui sont 2D pour les microscopes électroniques en transmission (MET) afin d’observer en général des organites, et 3D pour les microscopes électroniques à balayage (MEB) afin de visualiser les détails de la surface externe d’un échantillon.
- Le grossissement maximal est de pour les microscopes optiques, alors qu’il est égal à pour les MEB et supérieur à pour les MET.
- Le pouvoir de résolution maximal des microscopes optiques est de 200 nm , alors qu’il est de 0,5 nm pour les MEB et de 0,05 nm pour les MET.
