شارح الدرس: استنساخ تتابعات الحمض النووي (DNA) الأحياء • الصف الثالث الثانوي

في هذا الشارح، سوف نتعلَّم كيف نَصِف عملية تكوين الحمض النووي (DNA) المُعاد الاتحاد، باستخدام نواقل الاستنساخ، ونلخِّص كيف يُمكن استخدام إنزيم النسخ العكسي لاستنساخ مقاطع من الحمض النووي (DNA).

واحد من أبرز الإنجازات العلمية منذ السبعينيات هو اكتشاف تقنية الحمض النووي (DNA) المعاد الاتحاد. الحمض النووي المعاد الاتحاد هو الحمض النووي الذي يتكوَّن من مادة وراثية معزولة من مصدرين أو أكثر. يسمح لنا الحمض النووي المعاد الاتحاد بدراسة الجينات بمزيد من التفصيل، وتكوين مجموعات مثيرة للاهتمام من الجينات التي بإمكانها أن تكون نافعة للبشر.

يُعَدُّ الإنسولين أحد الأمثلة الرائعة على كفاءة هذه التقنية. فالإنسولين بروتين ضروري لتنظيم مستوى الجلوكوز الذي تمتصه الخلايا، وهو دواء ضروري لمرضى السكري. قبل اكتشاف تقنية الحمض النووي المعاد الاتحاد، كان الإنسولين يُستخرج ويُنقَّى في الغالب من الحيوانات (الأبقار أو الخنازير). ولكن، تسبب هذا المصدر في مشاكل مثل الرفض المناعي، وكان يكبِّد تكاليف باهظة. وعن طريق دمج الحمض النووي المسئول عن تخليق الإنسولين مع الحمض النووي البكتيري، أصبح من الممكن إدخال هذا الحمض النووي المعاد الاتحاد إلى البكتيريا وإنماؤها لتخليق نسخ عديدة منه. بفعل ذلك، استطعنا إنتاج الإنسولين البشري في البكتيريا بكمية كبيرة وبتكلفة أقل.

الحمض النووي المعاد الاتحاد في حد ذاته فكرة مهمة، لكن لكي يكون مفيدًا، علينا أن نتعرف على طريقة لعمل نسخ عديدة منه. وهنا يأتي الحديث عن تقنية معملية تسمى استنساخ الحمض النووي. المستنسخ هو نسخة وراثية من كائن حي آخر، أو نسخة من الحمض النووي نفسه.

استنساخ الحمض النووي تقنية تتيح لنا استنساخ أو عمل نسخ عديدة من تتابع الحمض النووي أو من الجين موضع الاهتمام. لفعل ذلك، يُعزل التتابع المطلوب من DNA ويُدمج مع DNA الحامل، ثم ينقل إلى خلايا مضيفة مناسبة (البكتيريا عادةً). داخل هذه البكتيريا، يتضاعف الحمض النووي المعاد الاتحاد ليخلّق نسخ عديدة من نفسه. وهذا يسمح بدراسة تتابع الحمض النووي بمزيد من التفصيل أو صنع البروتينات، كما هو الحال مع الإنسولين.

لاستنساخ DNA داخل البكتيريا، علينا أولًا وضع جزيء DNA في حامل متخصص لـ DNA. يسمى هذا الحامل (ناقل الاستنساخ)، وهو قطعة من DNA تعمل كأنها وسيلة نقل لحمل DNA إلى داخل الخلية. يوجد نوع من النواقل نستخدمه لفعل ذلك يسمى البلازميد.

اكتُشفت البلازميدات في الأصل في البكتيريا، وهي جزيئات غير كروموسومية دائرية الشكل من الحمض النووي DNA تحمل جيناتِ مقاوَمة المضادات الحيوية. ويمكن لعلماء البيولوجيا الجزيئية استخدامها لإدخال جزيء DNA موضع الاهتمام إلى الخلايا البكتيرية.

مثال ٢: فهم أصل البلازميدات المستخدَمة في عملية استنساخ الحمض النووي DNA

يُعَدُّ استخدام البلازميدات لتكوين حمض نووي مُعاد الاتحاد جزءًا مُهِمًّا من عملية استنساخ تتابعات الحمض النووي DNA.

في أيِّ الكائنات الحية الدقيقة اكتُشِفَت البلازميدات لأول مرة؟

1. الفيروسات.
2. الفطريات.
3. الطلائعيات.
4. البكتيريا.
5. الطحالب.

الحل

الحمض النووي المعاد الاتحاد هو الحمض النووي الذي يتكون من مادة وراثية معزولة من مصدرين أو أكثر.

ولكي نحقِّق النتائج المرجوة من استخدام الحمض النووي المعاد الاتحاد، علينا تخليق نسخ عديدة منه. يمكن تحقيق ذلك باستخدام طريقة تسمى استنساخ الحمض النووي DNA، وهذه الطريقة تسمح لنا بتخليق العديد من النسخ للتتابع المطلوب من جزيء DNA. أولًا، يجب عزل التتابع المطلوب من جزيء DNA ودمجه مع تتابع DNA الحامل الذي يُسمى بلازميد. والبلازميدات جزيئات دائرية غير كروموسومية من الحمض النووي، قد يحتوي بعضها على جينات مقاومة المضادات الحيوية. وقد اكتُشفت في الأصل في البكتيريا.

تسمح البلازميدات بنقل جزيء DNA إلى داخل البكتيريا. وبعد تخليق الحمض النووي المعاد الاتحاد باستخدام التتابع المطلوب من DNA وDNA البلازميدي، يُنقل الحمض النووي إلى داخل البكتيريا لاستنساخ التتابع المطلوب.

إذن، فالإجابة المحتملة الوحيدة لهذا السؤال هي الخيار (د): البكتيريا.

يمكن قطع البلازميدات باستخدام إنزيمات القطع لإدخال تتابع DNA موضع الاهتمام. وبقطع تتابع جزيء DNA والبلازميد باستخدام إنزيمات القطع نفسها، تنتج نهايات لاصقة متوافقة يمكن أن تندمج معًا. ولعلك تتذكر أن النهايات اللاصقة تنتج عند قطع جزيء DNA بإنزيم قطع، حيث تتكون عند هذه النهايات امتدادات من قواعد غير مزدوِجة لها ميل للتجاذب لبعضها البعض وفقا لمبادئ ازدواج القواعد المتكاملة. يمكنك رؤية ذلك في الشكل 1.

في الشكل 1، يمكننا أن نرى نهايتين لاصقتين متكاملتين يمكنها أن تندمجا معًا عن طريق أزواج القواعد المتكاملة فيهما. لكن هذا مجرد ارتباط ضعيف يعتمد على الروابط الهيدروجينية بين النيوكليوتيدات؛ ولذا نحتاج شيئًا أكثر ثباتًا واستمرارًا.

يمكن لإنزيم يسمى إنزيم الربط أن يربط هاتين النهايتين اللاصقتين معًا في عملية تسمى الارتباط. يمكن لهذا الإنزيم إصلاح الرابطة الفوسفاتية ثنائية الإستر التي تكسرت بفعل إنزيم القطع، لإعادة إصلاح الفراغات التي تكونت في البنية الأساسية المكونة من السكر والفوسفات. وهذه العملية موضَّحة في الشكل 2.

يوضح الشكلان 1 و2 جانبًا واحدًا من DNA موضع الاهتمام والبلازميد. تحدث الخطوات نفسها على الجانب الآخر؛ بحيث يمكن ربط القطعة الكاملة من الجزيء المطلوب من DNA في البلازميد. الشكل 3 يلخِّص العملية بأكملها.

مثال ٣: فهم أهمية النهايات اللاصقة المتكاملة في عملية استنساخ الحمض النووي DNA

خلال عملية تكوين الحمض النووي DNA المُعاد الاتحاد، لماذا يجب قطع كلٍّ من الجزء المرغوب من الحمض النووي وبلازميد البكتيريا باستخدام نفس إنزيم القطع؟

1. لتكوين نهايات لاصقة متكاملة.
2. لتقليل احتمالية رفض الخلية البكتيرية للحمض النووي DNA.
3. لتكوين نهايات غير لاصقة غير متكاملة.
4. للتأكُّد من أن الحمض النووي DNA والبلازميد لهما الحجم نفسه.
5. لتوفير المال.

الحل

يتكون الحمض النووي المعاد الاتحاد من مادة وراثية معزولة من مصدرين أو أكثر.

ولتحقيق النتائج المرجوَّة من استخدام الحمض النووي المعاد الاتحاد، علينا تخليق نسخ عديدة منه. يمكننا تحقيق ذلك باستخدام طريقة تسمى استنساخ الحمض النووي، وهذه تسمح لنا بتخليق العديد من النسخ من التتابع المطلوب من DNA. أولًا، يجب عزل التتابع المطلوب من DNA ودمجه مع تتابع حامل DNA الذي يسمى بلازميد.

ولدمج البلازميد مع التتابع المطلوب من DNA، تُستخدم إنزيمات القطع. يمكن لهذه الإنزيمات أن تقطع جزيء DNA عند تتابعات محددة لتترك إما نهايات لاصقة أو غير لاصقة. تسمى النهايات اللاصقة كذلك لأن لها ميلًا للتجاذب بينها وفقًا لقواعد ازدواج القواعد المتكاملة، وهي تلتصق بعضها ببعض فقط عند استخدم إنزيم القطع نفسه. لنلقِ نظرة على المثال التالي الذي يتحدث عن مقطع من DNA قُطِعَ باستخدام إنزيم القطع BamHI (الذي يتعرف على التتابع GGATCC).

نلاحظ في هذا المثال أنه بقطع كلا التتابعين باستخدام إنزيم القطع BamHI، يمكننا تكوين نهايات لاصقة متوافقة يمكن ربطها معًا. أما إذا استخدمنا إنزيمات قطع مختلفة، فستنتج نهايات لاصقة مختلفة غير متوافقة.

وبعد تخليق الحمض النووي المعاد الاتحاد باستخدام التتابع المطلوب من DNA وDNA البلازميدي، يُنقل إلى داخل البكتيريا لاستنساخ التتابع المطلوب.

إذن، فالإجابة الصحيحة هي الخيار (أ)، لتكوين نهايات لاصقة متكاملة.

بمجرد الانتهاء من تحضير الحمض النووي المعاد الاتحاد، يمكن إدخاله إلى الخلايا البكتيرية، في عملية تسمى التحول. وهنا تصبح الخلايا البكتيرية مُنْفِذَة بعد تعريضها لأيونات الكالسيوم ودرجات حرارة مرتفعة؛ مما يسمح للحمض النووي المعاد الاتحاد بالمرور عبر الغشاء الخلوي إلى سيتوبلازم البكتيريا.

يتضاعف الحمض النووي المعاد الاتحاد بمجرد إدخاله في الخلية البكتيرية لتخليق المزيد من النسخ. ويمكن أيضًا نسخه وترجمته إلى البروتينات المصاحبة. على سبيل المثال، إذا ما استنسخ جين الإنسولين في البلازميد ثم نُقل إلى داخل البكتيريا، يمكننا الحصول على بروتين الإنسولين من الخلايا البكتيرية، كما هو موضح في الشكل 4. لقد أحدث استنساخ الحمض النووي DNA ثورة في طرق إنتاج الإنسولين.

ثمة استخدامات أخرى عديدة لاستنساخ الحمض النووي.

لمحاربة الفيروسات، عزل الباحثون جينات الإنترفيرونات واستنسخوها. وهي بروتينات خاصة بإمكانها أن تمنع تضاعف الفيروسات (وتحديدًا الفيروسات التي تحمل الجينوم الذي يتكون من الحمض النووي الريبوزي RNA، مثل الإنفلونزا). داخل الجسم، تنطلق الإنترفيرونات من الخلايا المصابة بالفيروسات لحماية نفسها والخلايا المجاورة لها. في السبعينات، استُخلِص الإنترفيرون من خلايا بشرية لاستخدامه في أغراض طبية. لكن هذه العملية كانت مكلِّفة للغاية. وفي الثمانينيات، استُنسِخ 15 نوعًا مختلفًا من جينات الإنترفيرونات داخل البكتيريا لاستخدامها في تصنيع الإنترفيرونات بتكلفة معقولة جدًّا. يمكن أيضًا استخدام الإنترفيرونات لعلاج السرطان.

أما في مجال الزراعة، فقد استنسخ الباحثون جينات لمقاومة الآفات التي تصيب المحاصيل. وقد سمح ذلك للمزارعين بزراعة المحاصيل الغذائية دون رش مبيدات الآفات باهظة الثمن، وفي الوقت نفسه المحافظة على البيئة من هذه المواد التي يحتمل أن تكون سامَّة. كما أن الجينات التي تسمح للنباتات بإيواء البكتيريا المُثبِتة للنيتروجين على جذورها مطلوبة أيضًا؛ لأنها تغني عن الحاجة إلى استخدام الأسمدة النيتروجينية.

كما أدخلت تعديلات على الحمض النووي لذبابة الفاكهة لإثبات أنه يمكن نقل هذه التعديلات الجينية إلى النسل. في إحدى التجارب، أدخل الجين المسئول عن لون العيون الحمراء في أجنة ذبابة الفاكهة، التي ورث نسلها أيضًا هذا الجين.

استُنسِخت الجينات أيضًا في الثدييات. ففي الفئران، استنسخ الباحثون الجين البشري المسئول عن هرمون النمو، مما سمح للفئران بأن تنمو ضعف أحجامها.

إن عالم استنساخ الحمض النووي DNA مبهر للغاية، ومع ذلك، فالناس قلقون بشأنه. حيث يفترضون أن سلالة من البكتيريا قد تنتج سمًّا مميتًا وتطلقه إلى العالم. لكن مثل هذه التخوُّفات ليست واقعية؛ إذ تتخذ العديد من الإجراءات الوقائية فضلًا عن أن البكتيريا نفسها لا يمكنها البقاء على قيد الحياة خارج الظروف المعملية الخاصة.

والآن، دعونا نناقش كيفية عزل الحمض النووي المطلوب حتى نتمكن من استنساخه في البلازميد. لعلك تتذكر أنه يمكن نسخ الحمض النووي الريبوزي الرسول mRNA من DNA، الذي يمكن بعد ذلك ترجمته إلى بروتين.

يمكننا أن نعزل الخلايا التي تنتج جزيئات عديدة من نوع محدد من البروتين، على سبيل المثال، خلايا بيتا في البنكرياس المسئولة عن إنتاج الإنسولين، ثم نعزل الحمض النووي الريبوزي الرسول الذي يكوِّن هذا البروتين عن هذه الخلايا. لكن علينا أولًا تحويل mRNA نفسه إلى DNA إذا ما أردنا استنساخه في خلايا بكتيرية (نظرًا لأن إنزيمات القطع لا تتعرف إلا على الحمض النووي المزدوج الشريط).

تسمى عملية تحويل mRNA إلى DNA بالنسخ العكسي، ويسمى الإنزيم المسئول عن هذا التحول بإنزيم النسخ العكسي.

يستخدم هذا الإنزيم mRNA باعتباره قالبًا لتخليق شريط مكمل من DNA، ويُسمى الحمض النووي المكمل cDNA. ويكون cDNA عبارة عن شريط واحد من DNA. يتكون cDNA وفقًا لمبادئ ازدواج القواعد المتكاملة (حيث يزدوج الأدينين (A) مع الثايمين (T) ويزدوج الجوانين (G) مع السيتوزين (C))، لكن علينا أن ننتبه أن اليوراسيل (U) يزدوج مع الأدينين (A) بدلًا من الثايمين (T) في الحمض النووي الريبوزي RNA. يمكنك أن تطلع على كيفية تخليق الحمض النووي المكمل cDNA في الشكل 5.

مع ذلك، فتصنيع cDNA ليس كافيًا. فنظرًا لأنه جزئ أحادي الشريط، علينا إيجاد طريقة لتحويله إلى جزيء DNA مزدوج الشريط. يسمى الإنزيم الذي بإمكانه فعل ذلك بإنزيم بلمرة الحمض النووي. وهو إنزيم يحول جزيء DNA أحادي الشريط إلى DNA مزدوج الشريط، كما أنه الإنزيم المسئول عن تضاعف DNA في خلايا البشر. يمكنك ملاحظة ذلك في الشكل 6.

مثال ٥: فهم دور إنزيم النسخ العكسي وإنزيمات بلمرة الحمض النووي DNA في استنساخ الحمض النووي DNA

يوضِّح الشكل الآتي المُخطَّط الأساسي لكيفية استخدام إنزيم النسخ العكسي لنسخ مقطع من المادة الوراثية. ما دور إنزيم بلمرة الحمض النووي DNA في هذه العملية؟

1. لتكوين شريط مكمل من الحمض النووي للحمض النووي المكمل .cDNA
2. لتوفير موقع لتخليق شريط من الحمض النووي المكمل cDNA.
3. الربط بين الفراغات في هيكل السكر والفوسفات في الحمض النووي الريبوزي الرسول mRNA وجزيئات الحمض النووي المكمل .cDNA
4. تكوين شريط من الحمض النووي المكمل cDNA يكون متكامل مع الحمض النووي الريبوزي الرسول mRNA.
5. تكسير الروابط الهيدروجينية بين أزواج القواعد المتكاملة.

الحل

استنساخ الحمض النووي هي تقنية تتيح لنا استنساخ أو تخليق نسخ عديدة من تتابع DNA أو الجين موضع الاهتمام. ولفعل ذلك، يعزل التتابع المطلوب من DNA ويدمج مع جزيء DNA الحامل، ثم ينقل إلى خلية مضيفة مناسبة (البكتيريا عادة). داخل هذه البكتيريا، يتضاعف الحمض النووي المعاد الاتحاد لتخليق نسخ عديدة من نفسه. وهذا يسمح بدراسة التتابع بمزيد من التفصيل أو صنع البروتينات.

تتمثل إحدى طرق عزل تتابع من DNA من أجل استنساخه في تحويل mRNA المقابل له مرة أخرى إلى DNA. ولعلك تتذكر أنه يمكن نسخ mRNA من DNA، الذي يترجم بعد ذلك إلى بروتين. ولا بد من تحويل mRNA نفسه إلى DNA إذا أردنا استنساخه في خلايا بكتيرية. تسمى عملية تحويل mRNA مرة أخرى إلى DNA بالنسخ العكسي. ويسمى الإنزيم المسئول عن هذا التحويل بإنزيم النسخ العكسي.

يستخدم هذا الإنزيم mRNA باعتباره قالبًا لتخليق شريط مكمل من DNA يسمى الحمض النووي المكمل cDNA. ويكون cDNA عبارة عن شريط مفرد من DNA لا بد أن يتحول إلى شريط مزدوج من DNA لإتمام عملية الاستنساخ. يتم ذلك عن طريق إنزيم بلمرة الحمض النووي، الذي من الممكن أن يستخدم cDNA قالبًا لتخليق شريط مكمل آخر من DNA لإنتاج جزيء DNA مزدوج الشريط.

لنلقِ نظرة على الإجابات المحتملة. يبدو الخيار (أ) جيدًا؛ لأن هذا هو ما يفعله إنزيم البلمرة. أما الخيار (ب)، فلا يصف ما يفعله إنزيم البلمرة. أما الخيار (ج)، فيصف ما يفعله إنزيم الربط وليس إنزيم البلمرة. ويصف الخيار (د) ما يفعله إنزيم النسخ العكسي وليس إنزيم البلمرة. الخيار (هـ) لا يصف ما يفعله إنزيم البلمرة.

ومن ثَمَّ، فالإجابة الصحيحة هي الخيار (أ)، لتكوين شريط من الحمض النووي المكمل لـ cDNA.

وبمجرد تحويل cDNA إلى شريط مزدوج من DNA، يمكن معالجته عن طريق إنزيم الربط، الذي يتعرف فقط على جزيء DNA المزدوج الشريط، ولهذا السبب كان علينا استعراض جميع هذه المراحل. بعد هذه الخطوة، يصبح DNA جاهزًا للاستنساخ.

دعونا نلخِّص عملية تحويل mRNA إلى DNA مزدوج الشريط:

1. يُعزل mRNA لجين معين.
2. يُحول mRNA إلى cDNA عن طريق إنزيم النسخ العكسي.
3. يحول cDNA إلى DNA مزدوج الشريط عن طريق إنزيم البلمرة.
4. يمكن استخدام DNA المزدوج الشريط في عملية استنساخ الحمض النووي.

يوضح الشكل 7 نظرة عامة على العملية بأكملها.

توجد طرق أخرى لعزل الجين موضع الاهتمام. تتمثل إحداها في استخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR)، وهو تقنية متخصصة تستخدم في مضاعفة تتابع محدد من DNA باستخدام إنزيم يسمى تاك بوليميريز. وبينما يتطلب الاستنساخ نمو البكتيريا لاحتواء الحمض النووي المعاد الاتحاد، يمكن إجراء تفاعل البلمرة المتسلسل في أنبوب اختبار دون استخدام البكتيريا. يمكن لتفاعل البلمرة المتسلسل أن يفعل ذلك بتخليق العديد من النسخ من DNA المستهدف أو مضاعفته.

لنلخص بعض النقاط الرئيسية التي تناولناها في هذا الشارح.